b. Perhitungan konsentrasi ekstrak
Konsentrasi masing-masing larutan kerja ekstrak ditentukan berdasarkan asumsi konsumsi 100 ghari tepung jewawut dan besar rendemen ekstraknya yang langsung
diaplikasikan terserap semua dalam 6 liter darah. Setiap konsentrasi ekstrak tersebut divariasikan menjadi setengah kali, satu kali, dan dua kali konsentrasi ekstrak dalam darah.
Perhitungan yang berisi korelasi antara rendemen ekstrak heksana, ekstrak etil asetat, ekstrak etanol, ekstrak akuades, dan ekstrak
β -glukan dengan asumsi konsumsi tepung
pearl millet per hari ditunjukkan pada persamaan 4.a.4. Perhitungan besar konsentrasi kelima ekstrak tersebut yang terserap dalam 6 liter darah dan diaplikasikan dalam kultur sel
ditunjukkan pada 4.a.5.
c. Pembuatan larutan kerja ekstrak untuk kultur sel
Prosedur pembuatan larutan kerja ekstrak heksana, etil asetat, etanol, akuades, dan β- glukan telah dibuat secara terperinci dalam Lampiran 8, Lampiran 9, Lampiran 10,
Lampiran 11, dan Lampiran 12.
5. Kegiatan Pengujian Proliferasi Sel Limfosit Manusia secara In Vitro
a. Persiapan media kultur sel modifikasi Ramadhani, 2009
Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640 telah mengandung L- glutamine. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g dilarutkan dalam aquabidest, sehingga
diperoleh 1 liter larutan RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO
3
sebagai buffer dan 1 larutan antibiotik dalam larutan RPMI-1640 tersebut. Penelitian Ramadhani 2009
menggunakan larutan antibiotik gentamycin, namun dalam penelitian ini yang dipergunakan adalah larutan antibiotik penisilin-streptomisin. Campuran larutan tersebut
Rendemen ekstrak etanol =
Bobot ekstrak etanol x 100
Bobot substrat etil asetat 4.a.3
Konsentrasi ekstrak dalam darah =
Bobot asumsi konsumsi ekstrak tepung pearl millet per hari 4.a.5
6 liter darah Rendemen ekstrak etil asetat
= Bobot ekstrak etil asetat
x 100 Bobot substrat heksana
4.a.2 Rendemen ekstrak heksana akuades
β -glukan
= Bobot ekstrak
x 100 Bobot tepung awal
4.a.1
Bobot asumsi konsumsi ekstrak tepung pearl millet per hari = Rendemen ekstrak x 100 ghari
4.a.4
disterilisasi dengan membran steril 0.22 µm. Komposisi media RPMI-1640 disajikan pada Lampiran 13.
b. Isolasi sel limfosit manusia modifikasi Yanuwar, 2009; Pertiwi, 2009
Sel limfosit diisolasi dari darah seorang pria dewasa sehat. Kegiatan pendonoran darah dilakukan di klinik Farfa Darmaga oleh seorang perawat. Darah diambil dari seorang
responden secara aseptis dengan syringe dan jarum butterfly nomor 23 steril sekali pakai yang dihubungkan dengan tabung vacutainer mengandung antikoagulan EDTA. Jumlah
darah yang diambil adalah 2 x 15 ml. Sampel darah secepatnya dibawa ke laboratorium untuk pengerjaan prosedur isolasi sel limfosit. Sampel darah dalam vacutainer selanjutnya
dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi yang dilakukan secara aseptis di dalam laminar hood untuk menjamin keaseptisan proses.
Tahap pertama dari prosedur isolasi sel limfosit adalah pemisahan komponen selular dengan sentrifugasi sampel darah pada 1500 rpm selama 10 menit. Bagian darah yang lebih
berat eritrosit berada di bagian bawah warna merah, sedangkan serum darah terpisah di bagian atas warna kuning. Lapisan buffycoat yang sebagian besar berisi sel-sel darah
putih, khususnya sel limfosit, berada diantara kedua lapisan tersebut. Lapisan buffycoat tersebut selanjutnya dipindahkan ke tabung sentrifugasi steril baru
dengan sebelumnya membuang cairan serum yang bewarna kekuningan sebanyak ± 2-5 ml. Bagian lapisan buffycoat yang diambil berjumlah ± 5 ml termasuk bagian serum dan sedikit
bagian bewarna merah muda di atas eritrosit. Kemudian, tambahkan sejumlah RPMI dengan jumlah yang sama 1:1. Kedua larutan tersebut selanjutnya dicampur dengan cara
dikocok secara manual hingga homogen. Tahap kedua dari prosedur isolasi sel limfosit adalah memisahkan sel limfosit dari sel-
sel darah putih lainnya ataupun dari sel darah merah yang masih ada dalam suspensi sel tersebut. Tahap kedua ini dilakukan dengan menyiapkan tabung sentrifugasi kosong steril
yang kemudian diisikan 3 ml larutan ficoll-hystopaque densitas 1.77 ± 0.001 gml dan kemudian melewatkan lapisan buffycoat melalui larutan ficoll-hystopaque tersebut secara
perlahan dengan cara dialirkan melalui dinding tabung sehingga terbentuk dua lapisan. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi pada 2500 rpm selama 30 menit. Sel darah putih
yang tidak bergranula atau agranulosit, seperti sel limfosit dan monosit mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll-hystopaque sehingga posisinya akan berada di atas
permukaan yang terlihat seperti lapisan cincin putih. Sel darah merah dan granulosit akan terpisah di dasar tabung sentrifugasi karena berdensitas lebih tinggi.
Tahap ketiga adalah pengambilan lapisan cincin putih yang berisi sel limfosit dengan mikropipet secara perlahan dan dipindahkan ke tabung sentrifugasi baru yang steril.
Suspensi sel limfosit tersebut selanjutnya dicuci dengan penambahan 5 ml media RPMI. Campuran ini kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 10 menit dan
dicuci sebanyak dua kali. Setelah itu, supernatan dibuang kemudian suspensi sel limfosit ditambahkan 6 ml media RPMI dan selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah sel limfosit
awal.
c. Uji keberadaan sel limfosit dengan pewarna biru tripan modifikasi Yanuwar, 2009
Kategori