Pembuatan Kurva Tumbuh Uji Aktivitas Antibakteri

31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.10 Peremajaan bakteri uji

Peremajaan bakteri dilakukan dengan mengambil dari stok bakteri dalam agar miring Nutrient Agar NA diremajakan kembali pada Nutrient Agar NA miring baru dengan cara menggoreskan masing-masing bakteri menggunakan ose yang telah disterilkan dengan cara memijarkan pada api bunsen. Bakteri yang sudah digoreskan pada medium NA baru kemudian diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam Atikah, 2013. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow Jauhari, 2010.

3.11 Uji Kemurnian Bakteri Uji

Uji Kemurnian dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik. Pengamatan makroskopik bakteri uji dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni Rustanti, 2007. Bakteri uji diambil satu ose diletakkan diatas kaca objek yang telah ditetesi sedikit NaCl 0,9. Bakteri disebar pada kaca objek dengan menggunakan ose bulat kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan di atas api. Larutan kristal violet diteteskan di atas preparat dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian preparat dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian ditetesi cairan lugol dan dibiarkan selama 45-60 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir. Preparat dicuci lagi dengan etanol 96 dan digoyang-goyangkan selama 30 detik. Setelah itu safranin diteteskan di atas preparat dan dibiarkan selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan dengan tisu. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali Rachmayani, 2008. Bagan mengenai tahapan uji kemurnian bakteri dapat dilihat pada Lampiran 5.

3.12 Pembuatan Kurva Tumbuh

Bakteri uji pada medium agar miring diremajakan selama 18-24 jam pada suhu 35°C Rachmayani, 2008. Kurva tumbuh dibuat pada masing-masing bakteri untuk menentukan fase log dari bakteri yang akan diuji, saat terjadinya kecepatan pertumbuhan yang paling tinggi. Sebanyak 150 µL suspensi bakteri dimasukkan ke dalam 150 mL medium NB kemudian dilakukan perhitungan absorbansi pada panjang gelombang 600 nm. 32 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Perhitungan nilai absorbansi dilakukan setiap selang waktu 60 menit selama 24 jam, dimulai t=0 dan digunakan sebagai kurva standar. Bakteri diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 35°C Utami, 2009 dengan modifikasi. Bagan mengenai tahapan pembuata kurva pertumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 8.

3.13 Uji Aktivitas Antibakteri

Suspensi bakteri yang didapat dari kurva tumbuh diambil 1 mL dimasukkan secara aseptis ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan medium MHA sebanyak ±10 mL. Suspensi yang telah diberi agar dalam cawan petri digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi bakteri yang tersebar merata pada medium MHA Rachmayani, 2008. Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro dengan metode difusi cakram. Larutan uji yaitu supernatan isolat kapang dari hasil fermentasi diserapkan sebanyak 20 µL pada kertas cakram steril. Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan medium uji. Kontrol positif yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri yaitu menggunakan cakram kloramfenikol. Kontrol negatif yang digunakan yaitu aquades steril. Bakteri uji diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35°C. Amati zona hambatan yang terbentuk setelah inkubasi. Ukur diameter zona hambat dengan jangka sorong Atika, 2007 dengan modifikasi. Bagan mengenai tahapan uji aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Lampiran 9. 33 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN