tiga dikarenakan pada replikasi tiga yang paling menunjukkan selisih absorbansi yang paling stabil, sehingga hasil pengukuran dapat digunakan untuk menentukan
OT reaksi antara kuersetin dengan DPPH. Pada fraksi etil asetat Gambar 8 menunjukkan absorbansi yang stabil atau selisih absorbansi yang stabil mulai
pada 25-60 menit, sehingga ditentukan OT pada pengukuran fraksi etil asetat, yaitu 25 menit. Digunakan replikasi dua dalam penentuan OT fraksi etil asetat
dikarenakan sudah mewakili kedua replikasi lain yang menunjukkan OT pada menit ke-25.
H. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH
Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode penangkapan radikal terhadap radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil DPPH. Senyawa yang beraksi
sebagai penangkal radikal bebas akan mereduksi DPPH yang dapat diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning ketika elektron
ganjil dari radikal DPPH telah berpasangan dengan hidrogen dari senyawa penangkal radikal bebas yang akan membentuk DPPH-H tereduksi Molyneux,
2004. Hasil dari pengurangan warna ini merupakan stokiometri terhadap jumlah dari elektron yang ditangkap Bondet et al., 1997.
DPPH• + AH
↔
DPPHH + A• Pada penelitian ini digunakan pembanding yaitu kuersetin, yang
dimaksudkan untuk melihat potensi kekuatan fraksi etil asetat dibandingkan senyawa kuersetin. Penelitian yang dilakukan oleh Majewska et al. 2011
menunjukkan bahwa kuersetin merupakan senyawa flavonoid yang kuat sebagai
antioksidan. Dalam penelitian Howlader et al. 2012 disebutkan bahwa dalam ekstrak metanolik daun apel beludru memiliki kandungan alkaloid, tanin, gula,
getah dan flavonoid. Flavonoid jenis kuersetin ditemukan dalam tanaman yang masih satu genus dengan apel beludru Diospyros blancoi A. DC. yaitu pada
Diospyros virginiana L. Duke, 2001. Menurut Muharni 2010 profil kandungan kimia suatu spesies tumbuhan dalam satu genus umumnya akan menunjukkan
kandungan kimia yang mirip, maka dalam tanaman apel beludru dimungkinkan juga terdapat senyawa flavonoid yang mirip.
Senyawa antioksidan mendonorkan H pada DPPH• sehingga DPPH•
menjadi stabil DPPH-H. Setelah DPPH• mengikat H dan menjadi DPPH-H maka delokalisasi elektron tidak terjadi yang menyebabkan intensitas warna
menjadi berkurang. Intensitas warna DPPH yang berkurang sebanding dengan konsentrasi senyawa antioksidan yang semakin bertambah.
Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC
50
, yaitu konsentrasi yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50. Nilai IC
50
diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi
larutan uji dengan persen penangkapan radikal. Apabila nilai IC
50
semakin kecil maka semakin kuat aktivitas antioksidan senyawa dalam larutan yang sedang
diuji. Keuntungan metode DPPH ini adalah tes ini sederhana, cepat dan hanya
membutuhkan spektrofotometer UV-Vis untuk melakukan uji, sehingga metode ini digunakan secara luas dalam skrining antioksidan Prior et al., 2005.
Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
µgmL Absorbansi
kontrol Absorbansi
kuersetin IC
Persamaan regresi linier
5,10 0,701
17,82 7,65
0,564 33,88
I 10,2
0,853 0,468
45,13 y = 5,2365x–7,786
12,75 0,345
59,55 r = 0,9987
15,3 0,241
71,75 5,05
0,707 17,98
7,58 0,577
33,06 II
10,1 0,862
0,472 45,24
y = 5,3620x–8,5773 12,63
0,354 58,93
r = 0,9996 15,15
0,235 72,74
4,95 0,698
18,65 7,43
0,567 33,92
III 9,9
0,858 0,456
46,85 y = 5,5988x–8,5157
12,38 0,338
60,61 r = 0,9997
14,85 0,218
74,59 Tabel V menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi kuersetin yang
direaksikan dengan DPPH maka aktivitas antioksidannya semakin besar. Hal ini terlihat dari nilai IC yang semakin besar seiring dengan penambahan
konsentrasi kuersetin. Pengukuran aktivitas kuersetin dilakukan sebanyak tiga kali replikasi, masing-masing replikasi memiliki persamaan regresi linier. Persamaan
ini nantinya yang akan dipakai untuk menghitung nilai IC
50
dan kemudian dibuat reratanya.
Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin Replikasi 3
Gambar 9 menunjukkan bahwa nilai IC
50
yang didapat dari persamaan merupakan hasil intrapolasi. Grafik yang ditunjukkan Gambar 9 merupakan
hasil regresi linier dari replikasi tiga yang mewakili dua replikasi lainnya dikarenakan kedua replikasi yang lain juga menunjukkan hasil penghitungan IC
50
secara intrapolasi atau berada dalam rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengukuran seri konsentrasi kuersetin.
10 20
30 40
50 60
70 80
2 4
6 8
10 12
14 16
IC
Konsentrasi µgmL
Kurva konsentrasi kuersetin vs IC
y = 5,5988x – 8,5157 r = 0,9997
Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
µgmL Absorbansi
kontrol Absorbansi
larutan uji IC
Persamaan regresi linier
7,58 0,657
24,74 10,1
0,565 35,28
I 12,63
0,873 0,488
44,10 y = 3,7742x – 3,3781
15,15 0,397
54,52 r = 0,9992
17,68 0,325
62,77 7,5
0,646 25,58
10 0,566
34,79 II
12,5 0,868
0,456 47,47
y = 3,9124x – 3,489 15
0,393 54,72
r = 0,9972 17,5
0,308 64,52
7,43 0,675
23,38 9,9
0,589 33,14
III 12,38
0,881 0,481
45,40 y = 4,2910x – 9,1399
14,85 0,407
53,80 r = 0,9988
17,33 0,307
65,15 Tabel VI menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi fraksi etil asetat
yang direaksikan dengan DPPH maka aktivitas antioksidannya semakin besar. Hal ini terlihat dari nilai IC yang semakin besar seiring dengan penambahan
konsentrasi fraksi etil asetat. Pengukuran aktivitas fraksi etil asetat dilakukan sebanyak tiga kali replikasi, masing-masing replikasi memiliki persamaan regresi
linier. Persamaan ini nantinya yang akan dipakai untuk menghitung nilai IC
50
dan kemudian dibuat reratanya.
Gambar 10. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat
Gambar 10 menunjukkan bahwa nilai IC
50
yang didapat dari persamaan merupakan hasil intrapolasi. Grafik yang ditunjukkan Gambar 10 merupakan
hasil regresi linier dari replikasi satu yang mewakili dua replikasi lainnya dikarenakan kedua replikasi yang lain juga menunjukkan hasil penghitungan IC
50
secara intrapolasi atau berada dalam rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengukuran seri konsentrasi fraksi etil asetat.
Tabel VII. Hasil perhitungan IC
50
kuersetin dan fraksi etil asetat
Kuersetin
Replikasi IC
50
µgmL Rerata
µgmL SD µgmL
I 11,04
10,8 0,31
II 10,92
III 10,45
Fraksi etil asetat
Replikasi IC
50
µgmL Rerata
µgmL SD µgmL
I 14,14
13,9 0,25
II 13,67
III 13,78
10 20
30 40
50 60
70
5 10
15 20
IC
Konsentrasi µgmL
Kurva konsentrasi fraksi etil asetat vs IC
y = 3,7742x – 3,3781 r = 9992
Tabel VII menunjukkan hasil pengukuran aktivitas antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat. Rata-rata IC
50
kuersetin adalah 10,8±0,31 µgmL dan rata- rata IC
50
fraksi etil asetat adalah 13,9±0,25 µgmL. Untuk melihat apakah terdapat perbedaan yang bermakna antara IC
50
kuersetin dengan fraksi etil asetat, maka data aktivitas antioksidan diuji secara statistik. Software yang dipakai dalam
pengujian dengan statistik adalah R 2.14.1. Uji yang dilakukan pertama adalah uji normalitas untuk mengetahui
apakah data terdistribusi normal atau tidak. Menurut Dahlan 2009, uji normalitas menggunakan Shapiro-Wilk untuk data yang berjumlah kurang dari lima puluh.
Dengan menggunakan taraf kepercayaan 95 maka apabila nilai p 0,05 berarti data terdistribusi normal. Dari hasil perhitungan nilai p yang didapat untuk data
kuersetin adalah 0,3698 dan nilai p untuk fraksi etil asetat adalah 0,4309. Karena nilai p 0,05 maka data IC
50
kuersetin dan fraksi etil asetat terdistribusi normal. Dengan data yang terdistribusi normal maka dalam penyajian data digunakan
mean untuk ukuran pemusatan dan standar deviasi untuk ukuran penyebaran. Setelah uji normalitas maka dilanjutkan dengan uji variansi dengan Uji
F-Dua Variansi. Untuk sampel yang berjumlah dua kelompok digunakan Uji F- Dua Variansi Suhartono, 2008. Nilai p yang diperoleh, yaitu 0,7666 atau dapat
disimpulkan nilai p 0,05 yang berarti tidak ada perbedaan variansi IC
50
dari kuersetin dan fraksi etil asetat.
Setelah diketahui variansi data, lalu dilanjutkan dengan uji T tidak berpasangan. Uji T tidak berpasangan dilakukan untuk melihat apakah ada
perbedaan antara rerata IC
50
dari kuersetin dan fraksi etil asetat. Dari hasil
perhitungan dengan program R, didapatkan nilai p adalah 0,0001821. Karena nilai p 0,05 maka dapat disimpulkan bahwa rata-rata IC
50
dari kuersetin dan fraksi etil asetat berbeda bermakna, dengan rata-rata IC
50
dari fraksi etil asetat lebih besar dibandingkan rata-rata IC
50
dari kuersetin.
Tabel VIII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru
Intensitas Nilai IC
50
Kuersetin Fraksi etil asetat Sangat kuat
50 µgmL √
√ Kuat
50-100 µgmL -
- Sedang
101-150 µgmL -
- Lemah
150 µgmL -
- Berdasarkan nilai IC
50
yang diperoleh dari pengukuran aktivitas antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru
dengan metode DPPH, maka kuersetin dan fraksi etil asetat digolongkan dalam senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat karena nilai IC
50
kurang dari 50 µgmL Tabel VIII.
Hasil penelitian ini dengan menggunakan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru menghasilkan nilai IC
50
yang lebih rendah jika dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Das et al. 2010 dan
Howlader et al. 2012. Penelitian oleh Das et al. 2010 menggunakan ekstrak metanolik daun apel beludru yang diperoleh dari hasil maserasi selama tujuh hari
dan menghasilkan nilai IC
50
sebesar 72,50 µgmL. Penelitian yang dilakukan oleh Howlader et al. 2012 terhadap ekstrak metanolik daun apel beludru yang
diekstrak menggunakan metode reflux dengan metanol selama tiga jam menghasilkan nilai IC
50
sebesar 15±0,49 µgmL. Perbandingan nilai IC
50
dari ketiga penelitian menunjukkan bahwa fraksinasi menggunakan etil asetat dari
ekstrak metanolik daun apel beludru dapat menghasilkan aktivitas antioksidan yang lebih besar jika dibandingkan dengan aktivitas antioksidan ekstrak metanolik
daun apel beludru.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru sebesar 933,5 ± 6,62 mg ekuivalen asam galat per gram fraksi etil
asetat ekstrak metanolik daun apel beludru. 2. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel
beludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan sebagai IC
50
sebesar 13,9 ± 0,2 5 μgmL. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat
masuk dalam kategori sangat kuat.
B. Saran
Perlu dilakukan pemanenan daun apel beludru pada musim kemarau saat bunga mulai muncul dan sebelum berbuah. Pemanenan dilakukan pagi hari dua
jam setelah matahari terbit untuk mendapatkan metabolit sekunder yang maksimal.
58
