g. Penyerbukan Daun apel beludru dibuat menjadi serbuk dengan bantuan alat penyerbuk,
kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40. h. Pengepakan dan penyimpanan
Serbuk daun apel beludru kemudian dibungkus dengan menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan.
3. Ekstraksi
Daun apel beludru yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 50,0 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah pelarut pertama yaitu
metanol:air 9:1 sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui
penyaringan dengan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua, yaitu metanol:air 1:1 secukupnya
selama satu hari kemudian disaring. Filtrat hasil maserasi pelarut pertama dan kedua digabungkan, lalu filtrat diuapkan pelarutnya hingga volumenya menjadi
sepertiga dari volume awal. Diperoleh ekstrak metanolik daun apel beludru.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak metanolik daun apel beludru di ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : washbensin 1:1 vv,
kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas.
Hasil fraksinasi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi washbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat
dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat 1:1 vv sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan
dengan vacum rotary evaporator dan dimasukkan dalam cawan porselin yang sebelumnya telah ditimbang. Cawan berisi fraksi kental dimasukkan dalam oven
hingga 24 jam. Fraksi kering yang didapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji
a. Pembuatan larutan baku asam galat Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL
akuades : metanol p.a 1:1 sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat sebesar 1000,0 µgmL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL
larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a 1:1 sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100;
125; dan 150 µgmL. b. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a sampai 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut
ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. c. Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil
1,0 mL larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0
μgmL. d. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0
μgmL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0;
12,5; dan 15,0 μgmL.
e. Pembuatan larutan uji 1. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µgmL.
Kemudian larutan tersebut diambil 1,0 mL dan ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µgmL.
2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol
p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil 1,0 mL stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai
10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μgmL.
Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan
uji sebesar 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 μgmL.
6. Uji pendahuluan
