yang besar sehingga akan didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. Dalam
penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga konsentrasi, yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 50; 100; dan 150 µgmL. Hal ini
bertujuan agar dapat merepresentasikan panjang gelombang maksimum dari
konsentrasi yang berbeda. Panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga
konsentrasi tersebut adalah 751 nm Tabel II oleh karena itu, dalam pengukuran kandungan fenolik total digunakan panjang gelombang tersebut.
Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang
direaksikan dengan Folin-Ciocalteu
Konsentrasi larutan asam galat
λ maksimum hasil scanning
λ maksimum yang digunakan untuk
pengukuran λ maksimum
teoritis 150 µgmL
751 751
750 100 µgmL
751 50 µgmL
751
F. Estimasi Kandungan Fenolik Total
Menurut Bajcan et al. 2013 salah satu yang paling sering digunakan untuk penentuan total polifenol adalah metode spektrofotometri menggunakan
reagen Folin-Ciocalteu. Prinsipnya berdasarkan pada oksidasi senyawa fenolik dalam medium alkali dengan molibdenum dan tungsten fosfat untuk membentuk
kompleks berwarna biru. Intensitas berwarna biru kompleks tungsten-molibdenum dengan polifenol diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm.
Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion fenolik yang teroksidasi Singleton and Rossi, 1985.
Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekuivalen asam galat. Menurut Mongkolsilp, Pongbupakit, Sae-Lee and Sitthithaworn 2004 asam galat
dipilih karena tersedianya asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta harganya yang relatif lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang
lain. Menurut Prior et al. 2005, asam galat merupakan senyawa yang disarankan oleh Singleton and Rossi sebagai standar untuk penetapan fenolik total agar
pembacaan hasil pengukuran fenolik total dari penelitian yang berbeda dapat dibandingkan secara rasional.
Gambar 6. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total Replikasi 3
Dari ketiga replikasi yang dilakukan didapatkan masing-masing persamaan dan kemudian digunakan persamaan yang paling linier yang
ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linier yang paling baik diperoleh dari replikasi tiga Gambar 6 dengan y = 0,0054x – 0,0564 dan r sebesar 0,9997.
Penentuan kandungan fenolik total sampel menggunakan persamaan pada replikasi tiga dikarenakan nilai r yang paling baik, artinya bertambahnya
absorbansi yang dihasilkan proporsional dengan penambahan konsentrasi asam galat yang ditambahkan.
0,1 0,2
0,3 0,4
0,5 0,6
0,7 0,8
50 100
150 200
A b
so rb
a n
si
Konsentrasi µgmL
Kurva Baku Asam Galat
y = 0,0054x – 0,0564 r = 0,9997
Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru
Replikasi fenolik total
mg ekuivalen rata-rata
mg SD
mg I
926,6 II
934,1 933,5
6,62 III
939,8 Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi linier y = 0,0054x
– 0,0564; maka didapatkan rerata kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru sebesar 933,5 ± 6,62 mg ekuivalen asam galat per g
fraksi etil asetat Tabel III. Berdasarkan hasil uji penetapan fenolik total, fraksi etil asetat daun apel
beludru memiliki kandungan fenolik total sebesar 933,5 ± 6,62 mg ekuivalen asam galat. Kandungan fenolik senyawa uji besar dikarenakan dalam 1000 mg
fraksi etil asetat terdapat 933,5 ± 6,62 mg senyawa fenolik atau lebih dari 90 senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat apel beludru merupakan
senyawa fenolik. Metode Folin-Ciocalteu secara luas digunakan untuk menentukan
kandungan fenolik total, tetapi sebenarnya senyawa yang dapat bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu bukan hanya senyawa fenolik saja. Senyawa lain seperti
gula pereduksi, asam askorbat dan protein dapat mereduksi molibdenum dan tungsten fosfat membentuk kompleks berwarna biru. Oleh karena itu, metode
penetapan fenolik total menggunakan reagen Folin-Ciocalteu tidak spesifik bereaksi dengan senyawa yang mengandung gugus fenol saja.
G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan
