BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental rancangan acak sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.
B. Variabel
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel
beludru. 2.
Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan IC fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru.
3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu
pemanenan, umur daun yang dipanen, cara panen, dan jumlah g serbuk daun yang digunakan.
4. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim, curah hujan, dan
kelembaban.
C. Definisi Operasional
1. Daun apel beludru adalah daun folium dari tanaman apel beludru yang
dipanen dari kompleks Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.
18
2. Ekstrak metanolik adalah ekstrak daun apel beludru yang diperoleh dari hasil
maserasi dengan campuran metanol:air 9:1 dan 1:1 kemudian dipekatkan sampai semua metanol dapat teruapkan.
3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak metanolik dengan washbensin
1:1 kemudian fase air difraksinasi kembali dengan etil asetat 1:1. Fraksi etil asetat dikeringkan dalam oven selama 24 jam.
4. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi etil asetat untuk menangkap radikal DPPH. 5.
Persen inhibition concentration 50 IC
50
adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat yang menghasilkan penangkapan 50 radikal DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: daun apel beludru Diospyros blancoi A. DC. yang dipanen dari tanaman apel beludru di kompleks
Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta; akuades Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma. Bahan kimia kualitas pro analitik E.Merck meliputi metanol. Bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi
kuersetin, DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: metanol, washbensin dan etil asetat.
2. Alat penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer UV-VIS Shimadzu, vortex junke kunkel, corong Buchner, oven, mikropipet
10-1000 µL; 1-10 mL Acura 825, Socorex, neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary evaporator Junke Kunkel, tabung reaksi bertutup dan
alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.
E. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan
acuan dari web USDA 2013 dan Morton 1987.
2. Pembuatan dan penyiapan bahan
a. Pengumpulan bahan Tanaman apel beludru diperoleh dari kompleks Kampus III Universitas
Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan pada musim penghujan bulan Januari tahun 2013. Pemanenan dilakukan pagi hari
pukul 07.00 saat tanaman sedang berbuah dengan bahan yang dipakai adalah daun dewasa, yaitu daun yang berwarna hijau tua, berada pada ruas ketiga sampai
ketujuh pada tangkai daun, digunakan seluruh bagian daun untuk penelitian.
b. Sortasi basah Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah,
kerikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan ranting dan bunga, bagian dari tanaman lain tangkai, daun, bunga dan biji inang, bahan yang rusak
dan lain-lain. c. Pencucian
Daun apel beludru dicuci dengan cara dialiri air sumur sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian ini dilakukan sebanyak
tiga kali. d. Perajangan
Daun apel beludru dirajang dengan ukuran seragam, kurang lebih panjang daun menjadi 1 cm.
e. Pengeringan Daun apel beludru yang masih basah dikeringanginkan pada udara
terbuka dan terlindung dari sinar matahari. Cara pengeringan adalah bahan dihamparkan di atas kertas koran diatur agar tidak terlalu menumpuk. Posisi daun
harus sering dibalik sehingga pengeringan dapat merata. Akhir pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya daun apel beludru.
f. Sortasi kering Daun apel beludru yang sudah kering ditandai dengan mudah hancur
ketika diremas dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, kerikil, bahan yang rusak dan lain-lain tanpa pencucian.
g. Penyerbukan Daun apel beludru dibuat menjadi serbuk dengan bantuan alat penyerbuk,
kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40. h. Pengepakan dan penyimpanan
Serbuk daun apel beludru kemudian dibungkus dengan menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan.
3. Ekstraksi
Daun apel beludru yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 50,0 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah pelarut pertama yaitu
metanol:air 9:1 sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui
penyaringan dengan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua, yaitu metanol:air 1:1 secukupnya
selama satu hari kemudian disaring. Filtrat hasil maserasi pelarut pertama dan kedua digabungkan, lalu filtrat diuapkan pelarutnya hingga volumenya menjadi
sepertiga dari volume awal. Diperoleh ekstrak metanolik daun apel beludru.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak metanolik daun apel beludru di ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : washbensin 1:1 vv,
kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas.
Hasil fraksinasi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi washbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat
dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat 1:1 vv sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan
dengan vacum rotary evaporator dan dimasukkan dalam cawan porselin yang sebelumnya telah ditimbang. Cawan berisi fraksi kental dimasukkan dalam oven
hingga 24 jam. Fraksi kering yang didapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji
a. Pembuatan larutan baku asam galat Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL
akuades : metanol p.a 1:1 sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat sebesar 1000,0 µgmL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL
larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a 1:1 sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100;
125; dan 150 µgmL. b. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a sampai 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut
ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. c. Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil
1,0 mL larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0
μgmL. d. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0
μgmL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0;
12,5; dan 15,0 μgmL.
e. Pembuatan larutan uji 1. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µgmL.
Kemudian larutan tersebut diambil 1,0 mL dan ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µgmL.
2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol
p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil 1,0 mL stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai
10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μgmL.
Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan
uji sebesar 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 μgmL.
6. Uji pendahuluan
a. Uji keberadaan senyawa fenolik Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 μgmL dan larutan pembanding
asam galat 150,0 μgmL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv
ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 2,0 mL, kemudian amati warna larutan tersebut.
Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air:metanol 1:1 + pereaksi, fraksi etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Larutan DPPH diambil sebanyak 1,0 mL dimasukan ke dalam masing-
masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing dengan 1,0
mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 μgmL, dan larutan uji 200,0
μgmL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3,0 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah 30
menit, diamati warna pada larutan tersebut. Bandingkan juga dengan warna larutan fraksi etil asetat dan kuersetin tanpa ditambahkan DPPH.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time OT Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μgmL
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium
karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga
untuk larutan uji 100 μgmL dengan waktu pengamatan selama 60 menit. b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μgmL ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time, dibaca panjang gelombang pada absorbansi
maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μgmL
ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium
karbonat 1 M. Setelah operating time, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a
1:1, reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan tiga kali.
b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Diambil 0
,5 mL larutan uji 100 μgmL, lalu dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total
dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Dilakukan tiga kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5
mL larutan DPPH. Larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060.
Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan
maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
b. Penentuan operating time OT Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing
tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0
μgmL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut
kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516
nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 7,5; 12,5; 17,5 μgmL.
10. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH kontrol Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH.
Ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL
kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan
metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.
c. Estimasi aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 10a dan 10b, dihitung nilai IC dan IC
50
untuk kuersetin dan fraksi etil asetat.
F. Analisis Hasil
Aktivitas penangkapan radikal DPPH dihitung dengan rumus :
Absorbansi larutan kontrol – Absorbansi larutan pembanding atau larutan uji
Absorbansi larutan kontrol
x 100
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC
50
menggunakan persamaan regresi linier dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
pembanding, sedangkan sumbu y adalah IC. Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan antara rerata IC
50
larutan pembanding dan larutan uji. Uji secara statistik dilakukan menggunakan program
R versi 2.14.1. Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekuivalen asam galat
dalam per gram fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian.
Kebenaran identitas tanaman tersebut digunakan untuk menghindari adanya kemungkinan kesalahan dalam pengambilan sampel pada analisis fitokimia.
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan dari web USDA
2013 dan Morton 1987. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah
Diospyros blancoi A. DC. atau dikenal dengan nama apel beludru. Hal ini dibuktikan dengan surat determinasi lampiran 1 yang dikeluarkan oleh
Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Daun apel beludru diperoleh dari pohon apel beludru yang berada di kompleks Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo,
Sleman, Yogyakarta. Pengambilan bahan berasal dari satu tempat, hal ini bertujuan untuk menghindari variasi kandungan senyawa tanaman yang
disebabkan oleh perbedaan faktor edafik.
30
Kategori