eppendorf disentrifugasi 5 menit, 5000 rpm. Tahap selanjutnya adalah preparasi reagen annexin pada eppendorf yang dibalut alumunium foil diisi dengan 550 L
buffer dan diberi 10 Lannexin juga 10 L propidium iodida. Eppendorf yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi reagen 100 L lalu
diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 L buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometry CCRC, 2009.
9. Pengujian Ekspresi ER dengan Metode Imunositokimia
Pengujan imunositokimia dilakukan dengan menanam sel dalam 24 well- plate diberi cover slip jumlah sel 500.000 selmL sejumlah 1 mL. Setelah
inkubasi 24 jam dan sel sudah konfluen, media kultur dibuang lalu diberi 500 L PBS dan dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel dan
diinkubasi 24 jam, setelah inkubasi cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian
difiksasi menggunakan metanol 300 L lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi aquadest lalu dibuang dilakukan dua kali, diberi hidrogen peroksida 100
Lselama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi larutan blocking 100 L selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer ERα 100
L selama 1 jam setelah itu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi antibodi sekunder 100 L selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi
HRP sebanyak 100 L selama 10 menit kemudian dibuang dan diberi PBS, lalu diberi larutan DAB 100 L diinkubasi 3 menit dan diberi aquadest lalu dibuang.
Cover slip diberi 100 L Hematoxylin selama 5 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang juga xylol dan
segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih dahulu lalu diawetkan. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop CCRC, 2009.
F. Tata Cara Analisis Hasil
1. Analisis nilai IC
50
Menurut Doyle dan Griffiths 2000 nilai IC
50
adalah konsentrasi yang menghambat pertumbuhan 50 populasi sel untuk mengetahui
potensi sitotoksisitasnya. Data hasil ELISA reader berupa absorbansi Abs tiap sumuran dikonversikan dalam persentase kehidupan sel.
Absorbansi kontrol pelarut dianggap sama dengan absorbansi kontrol sel maka persentase sel hidup dihitung dengan rumus:
viabilitassel = Absseldenganperlakuan − Abskontrolmedia
Abskontrolsel − Abskontrolmedia ×100
Kemudian dihitung besar IC
50
menggunakan program R antara log konsentrasi dengan persen viabilitas sel.
2. Analisis apoptosis sel
Pengamatan kuantitatif dapat dilakukan dengan mengolah data hasil pembacaan flowcytometry dengan metode cellquest dan alat FACS
Calibur.
3. Analisis ekspresi ER
Pengamatan semi kuantitatif dilakukan dengan mengambil foto tiga lapang pandang sel di bawah mikroskop. Tiga subjek independen
menghitung sel yang berwarna coklat sebagai sel yang mengekspresikan ERα positif dan sel yang berwarna biru tidak mengekspresikan ERα
negatif. Sistem semi kuantifikasi mengikuti Vang dkk. 2006.
