dihaluskan menggunakan blender, serbuk disimpan dalam plastik clip yang diberi silika penjerap lembab dalam wadah tertutup di suhu ruang Alfredo, 2012.
4. Ekstraksi Simplisia Daun Rosemary
7,3 g serbuk simplisia daun rosemary 1. Ditambahkan metanol absolut 30 mL.
2. Direfluks selama 30 menit. 3. Proses refluks diulang tiga kali dengan penggantian pelarut.
4. Campuran disaring lalu digabungkan.
Gabungan ekstrak 1. Dipekatkan menggunakan rotary evaporator selama 5 menit.
2. Dikeringkan di atas waterbath pada suhu 80 C hingga mencapai
bobot tetap. Residu serbuk hijau tua
Diambil 0,5 g 1. Ditambahkan 10 mL metanol 60.
2. Divortex selama 1 menit. 3. Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
4. Disaring, endapan yang tertahan dikumpulkan.
Endapan 1. Ditambahkan 10 mL metanol absolut.
2. Disaring kemudian cairan dikumpulkan dan dipekatkan dengan rotary evaporator.
3. Dilanjutkan dengan pengeringan dengan waterbath pada suhu 80
C sampai mencapai bobot tetap. Serbuk ekstrak metanol daun rosemary
Gambar 7. Skema ekstraksi simplisia daun rosemary Abe, dkk., 2002.
5. Panen Sel
Pada awalnya sel ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga konfluen, kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan
mikropipet. Ke dalam cawan petri ditambahkan PBS untuk mencuci kemudian dibuang dan ditambahkan 0,5 mL tripsin secara merata dalam cawan petri, setelah
itu ditutup dan didiamkan selama 3 menit hingga sel terlepas di dalam inkubator. Setelah 4 menit ditambahkan media RPMI lengkap, dicuplik sedikit diamati di
bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel yang diperlukan selama pengujian dengan:
jumlahselkuadran1 + 2 + 3 + 4 4
× 10
mL Sejumlah sel terhitung yang diperlukan ditambahkan media RPMI hingga
10 mL dan dimasukkan sebanyak 100 L ke dalam 96 well-plate untuk uji MTT, 2 mL ke dalam 6 well-plate untuk uji Annexin V Fluos, dan 1 mL ke dalam 24
well-plate dengan cover slip untuk uji imunositokimia, diinkubasi selama 24 jam hingga konfluen CCRC, 2009.
6. Preparasi Larutan Uji
Sepuluh miligram sampel dilarutkan dalam 100 L DMSO kemudian dilakukan pengenceran ke seri konsentrasi yang diinginkan. Pada tahap
pengenceran sampel, digunakan media kultur sebagai pelarutnya CCRC, 2009.
7. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT
Sel yang telah diinkubasi selama 24 jam di dalam well-plate dan didapati telah konfluen dapat segera diberi perlakuan. Pertama media kultur dibuang
terlebih dahulu kemudian diberi 100 LPBS, lalu dibuang. Ke dalam tiap lubang
diberi 100 L sampel yang telah diencerkan, pada kolom kontrol sel cukup diberi media kultur sedangkan pada kolom kontrol media dapat dikosongkan saja, lalu
diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO
2
. Setelah inkubasi 24 jam, disiapkan larutan MTT yang telah dicampur dengan media kultur terlebih dahulu
kemudian media kultur dalam well-plate dapat dibuang lalu diberi 100 L PBS dan dibuang, ke dalam tiap lubang diberi 110 L larutan MTT dan diinkubasi
selama 4 jam. Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 L reagen stopper SDS kemudian diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan
pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595 nm CCRC, 2009.
8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos
Uji apoptosis sel menggunakan metode annexin dilakukan dengan menanam sel dengan populasi 500.000-1.000.000 selmL sejumlah 2 mL
kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah konfluen, media kultur dibuang kemudian diberi 100 L PBS lalu dibuang. Tiap lubang diberi sampel sebanyak 2
mL dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS,
kemudian diambil lagi dan dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 200 L tripsin diinkubasi selama 3 menit, lalu dilihat dengan mikroskop apabila
sel sudah terlepas diberi 1 mL media kultur dan ditampung lagi ke dalam conical tube. Conical tube disentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm.
Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam eppendorf sebanyak 1 mL. Campuran dalam
