Pengujian Ekspresi ER dengan Metode Imunositokimia

determinasi membuktikan bahwa tanaman tersebut benar merupakan tanaman Rosmarinus officinalis L. dan hasil determinasi terlampir. Penulis menggunakan metode ekstraksi refluks yang diambil dari jurnal Abe dkk. 2002. Metode ekstraksi dengan refluks biasa digunakan untuk mengekstraksi solid pada penelitian ini adalah serbuk simplisia daun rosemary. Metode ini adalah cara alternatif yang cepat menggunakan pemanasan, sehingga pelarut yang dibutuhkan tidak terlalu banyak dan kehilangan substansi dapat dikendalikan karena pelarut yang diuapkan akan berkondensasi dan kembali mengekstrak simplisia. Pelarut yang digunakan harus dapat melarutkan senyawa yang diharapkan, memiliki titik didih lebih rendah dari senyawa target sehingga kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metode refluks dapat digunakan pada metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik lebur yang tinggi yaitu sekitar 292-300 C dan metanol digunakan karena memiliki titik didih 64,5 C sehingga dapat menguap dalam sistem refluks selain itu metanol diketahui dapat melarutkan senyawa target dengan baik. Gambar 8. Struktur senyawa dalam ekstrak Abe, dkk., 2002 dan ligan ER A. Asam Betulinat, B. Asam Oleanolat, C. Asam Ursolat, D. 17--Estradiol Penulis mengekstraksi 7,3 g serbuk daun rosemary dengan metanol dan didapatkan serbuk ekstrak metanol daun rosemary sebanyak 0,1507 g. Abe dkk. 2002 menyatakan bawah di dalam ekstrak ini didapatkan tiga komponen yaitu A B C D asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antiproliferatif pada T47D diperkirakan disebabkan oleh kandungan asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat tersebut Gambar 8. Gambar 8 menunjukkan kesamaan antara ketiga senyawa yang terdapat di dalam ekstrak metanol daun rosemary dengan ligan ERα, yaitu cincin aromatis satu; dua; tiga; dan gugus fungsi hidroksil pada cincin satu.

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Metanol Daun Rosemary dengan Metode MTT

3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide atau MTT adalah metode kolorimetrik standar yang digunakan untuk mengukur perubahan warna pada analisis proliferasi sel dan sitotoksik sel terhadap agen dengan kemampuan toksik dan medis. MTT adalah larutan berwarna kuning yang dapat berubah ke bentuk formazan yang tidak larut Gambar 9. MTT direduksi oleh sel yang metabolismenya aktif ke formazan ungu oleh suksinat tetrazolium reduktase ke dalam enzim rantai pernapasan pada mitokondria. Formazan ungu dapat larut ketika diberi SDS sehingga dapat dibaca absorbansinya dan dihasilkan kurva yang berguna untuk mengetahui IC 50 sampel. Gambar 9. Kristal formazan yang terbentuk pada uji MTT. A. Sel T47D tanpa perlakuan, B. Dengan pemberian tamoxifen 1 , dan C. Dengan pemberian ekstrak metanol daun rosemary Rosmarinus officinalis L. 30