diberi 100 L sampel yang telah diencerkan, pada kolom kontrol sel cukup diberi media kultur sedangkan pada kolom kontrol media dapat dikosongkan saja, lalu
diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO
2
. Setelah inkubasi 24 jam, disiapkan larutan MTT yang telah dicampur dengan media kultur terlebih dahulu
kemudian media kultur dalam well-plate dapat dibuang lalu diberi 100 L PBS dan dibuang, ke dalam tiap lubang diberi 110 L larutan MTT dan diinkubasi
selama 4 jam. Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 L reagen stopper SDS kemudian diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan
pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595 nm CCRC, 2009.
8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos
Uji apoptosis sel menggunakan metode annexin dilakukan dengan menanam sel dengan populasi 500.000-1.000.000 selmL sejumlah 2 mL
kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah konfluen, media kultur dibuang kemudian diberi 100 L PBS lalu dibuang. Tiap lubang diberi sampel sebanyak 2
mL dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS,
kemudian diambil lagi dan dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 200 L tripsin diinkubasi selama 3 menit, lalu dilihat dengan mikroskop apabila
sel sudah terlepas diberi 1 mL media kultur dan ditampung lagi ke dalam conical tube. Conical tube disentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm.
Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam eppendorf sebanyak 1 mL. Campuran dalam
eppendorf disentrifugasi 5 menit, 5000 rpm. Tahap selanjutnya adalah preparasi reagen annexin pada eppendorf yang dibalut alumunium foil diisi dengan 550 L
buffer dan diberi 10 Lannexin juga 10 L propidium iodida. Eppendorf yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi reagen 100 L lalu
diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 L buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometry CCRC, 2009.
9. Pengujian Ekspresi ER dengan Metode Imunositokimia
Pengujan imunositokimia dilakukan dengan menanam sel dalam 24 well- plate diberi cover slip jumlah sel 500.000 selmL sejumlah 1 mL. Setelah
inkubasi 24 jam dan sel sudah konfluen, media kultur dibuang lalu diberi 500 L PBS dan dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel dan
diinkubasi 24 jam, setelah inkubasi cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian
difiksasi menggunakan metanol 300 L lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi aquadest lalu dibuang dilakukan dua kali, diberi hidrogen peroksida 100
Lselama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi larutan blocking 100 L selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer ERα 100
L selama 1 jam setelah itu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi antibodi sekunder 100 L selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi
HRP sebanyak 100 L selama 10 menit kemudian dibuang dan diberi PBS, lalu diberi larutan DAB 100 L diinkubasi 3 menit dan diberi aquadest lalu dibuang.
Cover slip diberi 100 L Hematoxylin selama 5 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang juga xylol dan
