oleh hilangnya ion K
+
dan Cl
-
tapi terjadi peningkatan Ca
2+
sehingga kanal K
+
yang diaktivasi Ca
+
dapat bekerja Trump, dkk., 1997. Mekanisme nekrosis lainnya melalui regulasi volume dan ion sel yang
ditandai dengan peristiwa onkosis di mana kendali pengaturan volume cairan hilang, hal ini dapat terjadi karena defisiensi ATP juga kerusakan langsung pada
membran plasma. Telah disebutkan sebelumnya bahwa peningkatan ion Ca
2+
dapat menyebabkan onkosis tapi pada beberapa sel dapat pula terjadi apoptosis, selain itu ion Ca
2+
mempengaruhi transkripsi gen juga fungsi sitoskeletal Trump, dkk., 1997.
F. Uji Sitotoksik
Kinerja, reprodusibilitas, dan kemampuan studi untuk diperbandingkan memerlukan kuantifikasi sel. Metode klasik yang dapat digunakan adalah
perhitungan langsung menggunakan haemocytometer, dihubungkan dengan pewarnaan seperti triptan biru untuk membedakan sel hidup dan mati. Metode
klasik ini memang mudah, murah, dengan jumlah sel yang sedikit akan tetapi masih bersifat subjektif. Dewasa ini telah banyak metode yang dikembangkan dan
lebih sesuai seperti deteksi dengan pelabelan radiokromium, ATP selular, volume intraselular, pewarnaan spesifik, potensi redoks, uji turbiditas, kalorimetri, dan
monitoring biomassa Doyle dan Griffiths, 2000. Dalam penelitian ini digunakan metode pewarnaan spesifik yaitu 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl
Tetrazolium Bromide MTT.
Garam tetrazolium telah dikembangkan sebagai alat pengukuran warna secara kuantitatif untuk menentukan proliferasi dan kemampuan bertahan
hidupnya sel. Uji ini mengukur jumlah sel yang hidup bukan sel yang mati, dan sinyal berasal dari derajat keaktifan masing-masing sel. Hasilnya dapat dibaca
pada multiwell scanning spetrophotometer ELISA reader dan menunjukkan hasil dengan presisi tinggi. Metode ini dapat mengurangi proses pencucian yang
tidak diperlukan sehingga mampu mengurangi waktu dan jumlah sampel yang diperlukan. Kelebihan metode ini adalah keakuratan dan kepresisiannya, juga
minimnya gangguan radioisotop Mosmann, 1983.
Gambar 5. Mekanisme reaksi pada pembentukan kristal formazan Talupula, 2011
MTT adalah uji reduksi tetrazolium untuk uji viabilitas sel homogen yang dikembangkan pada wadah dengan 96 lubang yang cocok untuk hasil
pemilahan yang baik. Substrat MTT disiapkan dalam larutan pada kondisi fisiologis, ditambahkan ke dalam kultur sel, biasanya pada kadar 0,2–0,5 mgmL,
dan diinkubasi selama satu sampai empat jam. Jumlah formazan yang sebanding langsung dengan jumlah sel yang hidup diukur menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang 570 nm. Sel yang hidup dengan metabolisme akif dapat mengubah MTT ke formazan berwarna ungu yang dapat dibaca absorbansinya.
Ketika sel mati tidak dapat mengubah MTT menjadi formazan, sehingga intensitas warna yang muncul spesifik untuk sel hidup Riss, dkk., 2014.
G. Annexin V Fluos
Apoptosis tahap awal ditandai dengan tersebarnya sel tunggal sehingga tidak dapat dikenali lagi, dan pada tahap akhir badan apoptosis mengalami
fagositosis cepat, proses ini terjadi hanya dalam beberapa jam. Perubahan pada permukaan sel apoptik seperti ekspresi sisi ikatan trombospondin, hilangnya
residu asam sialik, dan paparan fosfatidilserin menjadi sulit dikenali. Fosfatidilserin adalah fosfolipid yang bermuatan negatif, yang biasanya muncul
pada ujung membran berhadapan dengan sitosol. Paparan fosfatidilserin pada permukaan sel mengaktivasi platelet dan eritrosit tua, sel yang akan hancur oleh
apoptosis Vermes, dkk., 1995. Annexin V ditemukan sebagai protein pembuluh darah yang memiliki
aktivitas kuat antikoagulan, sebagai keluarga multigen protein yang memiliki urutan yang berulang yang disebut loop endoxin. Annexin dapat berikatan dengan
fosfolipid dengan bantuan Ca
+
. Annexin V berikatan secara spesifik terhadap fosfolipid seperti fosfatidilserin, yang biasanya tidak ada di luar permukaan
membran plasma, dan menunjukkan ikatan minim dengan fosfolipid lain seperti fosfatidilkolin dan spingomielin yang ada di permukaan membran plasma
Vermes, dkk., 1995. Ketika kematian sel terjadi, fosfatidilserin berpindah ke permukaan
membran bagian terluar sel. Ini terjadi pada fase awal dari kematian sel akibat
apoptosis di mana membran sel masih utuh. Nekrosis di sisi lain, mengalami penurunan integritas membran dan kebocoran selular dari dalam sel ke
lingkungan. Oleh sebab itu, pengukuran ikatan Annexin V diikuti dengan pewarnaan dapat memberikan pengukuran yang tepat untuk mendeteksi sel yang
mengalami apoptosis dan membedakannya dari yang mengalami nekrosis Vermes, dkk., 1995.
H. Imunositokimia
Imunohistokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein, antigen dalam jaringan dengan mendeteksi reaksi antigen antibodi dengan bantuan
penanda. Pewarna fluoresen dan enzim adalah yang paling banyak digunakan. Metode pewarnaan jaringan ini disebut immunostaining. Proses yang mirip untuk
mendeteksi antigen pada sel disebut imunositokimia. Langkah-langkah pengerjaan dalam imunositokimia ini adalah aktivasi antigen, blocking
peroksidasi endogen, inkubasi antibodi primer, inkubasi antibodi sekunder, deteksi antibodi, counter stainning, dan penutupan slide. Blocking peroksidase
endogen dapat mencegah reaksi tidak spesifik saat pewarnaan, larutan yang dipakai adalah hidrogen peroksidase. Pencucian dengan Phosphate Buffer Saline
PBS penting dilakukan agar tidak ada reagen tersisa dari perlakuan sebelumnya. Inkubasi antibodi primer dilakukan untuk memberi waktu reaksi antara antibodi
primer tidak berlabel dengan antigen, selanjutnya dilakukan inkubasi antibodi sekunder berlabel dapat memberikan warna pada reaksi yang terjadi di antigen
antibodi jaringan atau sel. Counterstain menggunakan pewarna Mayer Hematoxylin yang memberi warna biru pada nukleus. Penutupan slide dilakukan
agar preparat yang sudah jadi bisa lebih tahan lama dengan menggunakan lem khusus antara kaca preparat, cover slip, dan penutup preparatnya. Pengamatan
preparat dilakukan dengan menggunakan mikroskop Prabin, dkk., 2009.
I. Tanaman Rosemary dan Ekstrak Metanol Daun Rosemary
Gambar 6. Tanaman Rosemary Deymos, 2010
Rosemary merupakan herba dari famili Lamiaceae yang berasal dari daerah Mediterania. Klasifikasi rosemary adalah sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Superdivision : Spermatophyta
Division : magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Subclass : Asteridae
Order : Lamiales
Family : Lamiaceae
