Pola Pertumbuhan KalusSel Tanaman

29 3 INISIASI KALUS EMBRIOGENIK DENDROBIUM Abstrak Induksi dan inisiasi kalus embriogenik KE, sebagai tahap kritikal perbanyakan benih secara in vitro dengan metode secara tak langsung, telah berhasil dikembangkan pada kultur in vitro Dendrobium melalui seleksi genotipe D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’, jenis eksplan tunas pucuk,tunas lateral dan daun plantlet, media medium ½ MS ditambah dengan kombinasi 1.0 dan 1.5 mg L -1 TDZ dengan 0.5 dan 1.0 mg L -1 BA, medium VW dengan kombinasi 1.0 dan 2.0 mg L -1 TDZ dengan 0.5 dan 1.0 mg L -1 kinetin, sistem kultur padat dan cair dan kondisi inkubasi terang dan gelap. Penelitian ini disusun menggunakan Rancangan Acak Kelompok RAK pola faktorial dua faktor dengan tiga ulangan, yaitu faktor genotipe dikombinasikan dengan keempat faktor lainnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa inisiasi KE teroptimal ditemukan pada eksplan tunas pucuk plantlet D. Indonesia Raya ‘Ina’ yang dikultur pada medium IM-3 medium ½ MS yang ditambah 1.5 mg L -1 TDZ, 0.5 L -1 BA, 20 g L -1 sukrosa dan 2 g L -1 gelrite, menggunakan sistem kultur padat dan diinkubasi pada kondisi terang dengan fotoperiode terang 12 jam di bawah lampu fluorescen dengan intensitas cahaya 13 µmol m -2 s -1 pada suhu 23.5 ± 1.1 ° C. KE terinisiasi ± 7.1 hari setelah kultur diinkubasi dengan 99.7 keberhasilan regenerasi eksplan dengan 98.7 pembentukan KE, 0.37 g bobot basah KE, dan 4.23 mm 3 ukuran KE. Metode dan KE yang berhasil diperoleh pada tahap ini memiliki potensi yang besar pada penyiapan galur sel unggul Dendrobium yang akan dijadikan sebagai kultur starter untuk tahap proliferasi KE. Kata kunci: eksplan, genotipe, media, kondisi inkubasi, sistem kultur Abstract Induction and initiation of embryogenic callus EC, as the most critical step in vitro propagation indirectly, was successfully established in in vitro culture of Dendrobium via selection of genotypes D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’, explant types shoot tips, lateral shoots and young leaves, media half-strength MS supplemented with combination of 1.0 and 1.5 mg L -1 TDZ and 0.5 and 1.0 mg L -1 BA; VW medium in combination of 1.0 and 2.0 mg L -1 TDZ and of 0.5 and 1.0 mg L -1 kinetin, culture systems solid and liquid and incubation culture conditions light and dark. The factorial experiments were arranged using a randomized completely block design RCBD with three replications. The results showed that the optimal embryogenic callus initiation was established on shoot tips of D. Indonesia Raya ‘Ina’ as explant source cultured on IM-3 medium semi solid half-strength MS medium containing 1.5 mg L -1 TDZ and 0.5 mg L -1 BA under light incubation of 12 h photoperiod of cool fluorescent lamps with 13 µmol m -2 s -1 light intensity at 23.5 ± 1.1 ° C. The EC was successfully initiated in the shortest period as low as 7.1 day after culture with 99.7 explant regeneration, 98.7 EC formation, 0.37 g fresh weight of EC, and 4.23 mm 3 size of EC. The established-method and EC produced have high 30 potentially applied to other Dendrobium hybrids in producing superior cell lines as the starter culture for EC proliferation. Keywords: explants, culture systems, genotypes, incubation conditions, media

3.1 Pendahuluan

Inisiasi pembentukan kalus embriogenik KE merupakan salah satu langkah yang sangat penting, kritikal dan menentukan keberhasilan teknik kultur in vitro melalui jalur embriogenesis somatik secara tidak langsung George et al. 2007, termasuk pada Dendrobium. Keberhasilan inisiasi KE pada Dendrobium telah dilaporkan dengan menggunakan genotipe, jenis dan umur eksplan, kombinasi media dasar dan zat pengatur tumbuh zpt, jenis mediasistem kultur, dan kondisi inkubasi yang berbeda Meesawat Kanchanapoom 2002; Martin Madassery 2006; Anjum et al. 2006; Roy et al. 2007; Zhao et al. 2008; Mei et al. 2012; Rafique et al. 2013; Farul et al. 2014. Kesesuaian semua faktor penentu tersebut akan menghasilkan KE yang optimal dan berkualitas. Beberapa studi inisiasi KE pada Dendrobium telah dilaporkan. KE D. crumenatum berhasil diinisiasi dari tunas aksiler selama 4 minggu inkubasi yang dikultur pada medium Vacin and Went Vacin Went 1949;VW yang ditambah dengan 1 mg L -1 N 6 -benzyladenine BA, 0.1 mg L -1 α-naphthaleneacetic acid NAA, 2 g L -1 pepton, dan 2 g L -1 arang aktif dibawah inkubasi terang 16 jam fotoperiode Meesawat Kanchanapoom 2002. Daun yang dikultur pada medium ½ Murashige and Skoog Murashige Skoog 1962; MS padat dengan 44.4 µM BA, diinkubasi terang 16 jam fotoperiode sesuai untuk induksi plbs D. Sonia 17 dan 18 Martin Madassery 2006, potongan daun dikultur pada medium MS padat yang ditambah 2 mg L -1 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4- D, diinkubasi pada kondisi terang 16 jam fotoperiode sesuai untuk D. malones Anjum et al. 2006, potongan plbs dikultur pada medium MS ½ makro elemen dan mikro elemen penuh padat yang ditambah 8.8 µM BA, disubkultur 2 kali 40 hari sekali, diinkubasi gelap selama 40 hari kemudian dipindahkan pada kondisi terang 12 jam fotoperiode sesuai untuk induksi KE D. candidum Zhao et al. 2008, tunas pucuk 4-5 mm dikultur pada medium MS padat yang ditambah 2 µM 1-Phenyl-3-[1,2,3-thidiazol-5-yl] urea TDZ atau 2 µM N 6 - benzylaminopurine BAP, diinkubasi dibawah kondisi terang dengan 10 jam fotoperiode sesuai untuk D. chrysotoxum Roy et al. 2007, plbs dikultur pada MS padat yang mengandung 1.0 mg L -1 NAA dan 0.1 mg L -1 2,4-D diinkubasi pada terang sesuai untuk D. ‘Sonia 28’ Mei et al. 2012, plbs dikultur pada medium MS padat yang ditambah 5 g L -1 sukrosa diinkubasi terang sesuai untuk D. sabin Rafique et al. 2013. Hasil-hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa tiap Dendrobium memiliki respon yang spesifik dan memerlukan kesesuaian yang berbeda baik sumber eksplan, media, sistem kultur maupun kondisi inkubasinya. Meski kondisi yang optimal beberapa Dendrobium telah dilaporkan, namun kondisi yang sesuai untuk D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya ‘Ina’ dan D. Sonia ‘Earsakul’ belum pernah diteliti dan dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode inisiasi KE Dendrobium teroptimasi dengan mempelajari pengaruh faktor genotipe, jenis eksplan, media, 31 sistem kultur dan kondisi inkubasi dalam rangka pembuatan galur sel unggul Dendrobium yang akan dijadikan sebagai tanaman model untuk kegiatan penelitian selanjutnya. Diharapkan dari penelitian ini dihasilkan protokolmetode induksi KE Dendrobium yang efektif dan efisien yang mampu menghasilkan KE secara mudah, cepat dan dalam jumlah banyak dan galur selKE terseleksi.

3.2 Bahan dan Metode

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Rumah Kaca Anggrek Balai Penelitian Tanaman Hias Segunung, Pacet, Cianjur, mulai bulan Maret hingga Agustus 2013.

3.2.1 Bahan dan Alat

Bahan kimia yang digunakan ialah komponen media MS dan VW Merck, Germany, zpt TDZ, BA, NAA, dan Kinetin Phytotech, USA, gelrite Duchefa-Biochemie, Netherland, sukrosa Merck, Germany, vitamin niacin, pyridoxine HCl, thiamin, myo inositol Phytotech, USA, alkohol 96, Natrium klorida NaOCl Bayclin-Johnson Home Hygiene Products Ltd, Indonesia, Tween-20 Sigma-Aldrich, St. Gallen, Germany dan air destilasi. Alat yang digunakan adalah autoclave Pressure Sterilizer Model No.1941X, Foundry Co. Inc., WI, USA, laminar air flow cabinet Labconco, USA, timbangan analitik Sartorius BP 1200, Germany; Explorer Ohaus, Switzerland, pH meter Model 420A Thermo Orion, USA, syringe Sacorex 173, Swiss, hot plate stirer Heidolph MR 3001 K, Germany, pinset Yamaco, Japan, pisau kultur BB511 Aesculap AG Co. KG AM, Germany, scalpel Yamaco, Japan, orbital shaker GFL 3017, Germany, mikroskop epifluoresen Nikon-Labophot-2, Japan, mikroskop stereo Stemi SV8 Zeiss, Germany, mikroskop inverted Belengineering SRL, Italy, lux meter Lutron LX 101, Taiwan, thermo-hygrometer Haar-Synth-Hygro, Germany, lampu SL- Shinyoku, Indonesia, microtome Kedee, China, dan kamera digital Nikon DX 40, Japan; Panasonic DMC-FZ7-Lumix, Japan. Tanaman donor yang digunakan ialah: 1 D. ‘Gradita 10’ D. Sonia ‘Deep Pink ’ x D. aksesi 1265, hasil persilangan pemulia anggrek Balai Penelitian tanaman Hias yang dirilis pada tahun 2010; 2 D. Indonesia Raya ’Ina’ D. ‘Kim Bora’ x D. ‘Wee Lian’, hasil persilangan pemulia swasta asal Malang ‘Wirakusumah Silamurti’ yang dirilis pada tahun 2006, diperoleh dari Edward and Frans Orchids Malang; dan 3 D. Sonia ’Earsakul’ D. ‘Caesar’ x D. ‘Tommy Drake’ diperoleh dari Pusat Pengembangan Benih Tanaman Pangan, Hortikultura, dan Kehutanan Provinsi DKI Jakarta Gambar 3.1; Lampiran 1,2, dan 3.