34
ke dalam botol kultur Ø 2.5 cm dan tinggi 5.5 cm yang berisi 2.5 mL media perlakuan untuk inisiasi KE IM Gambar 3.3.
Kultur diinkubasikan sesuai dengan perlakuan, yaitu pada kondisi gelap dan fotoperiode 12 jam terang dengan intensitas
cahaya 13 μmol m
-2
s
-1
pada suhu 23.5 ± 1.1 ºC dengan kelembaban 60-70 hingga terbentuk KE. Khusus untuk
kultur cair dikocok di atas orbital shaker dengan kecepatan ± 100 rpm. Kalus- kalus yang terinisiasi diamati pertumbuhannya hingga ± 1 bulan dan kemudian
diseleksi untuk mendapatkan galur-galur selkalus unggul. Kalus embriogenik KE yang memiliki pertumbuhan yang cepat, seragam dengan penampilan hijau
segar dan remah digunakan pada tahap percobaan selanjutnya.
3.2.4 Kegiatan Penelitian 3.2.4.1 Pengaruh Kultivar dan Jenis Eksplan Terhadap Inisiasi KE
Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan jenis eksplan terbaik untuk inisiasi KE Dendrobium
. Plantlet umur ± 3 bulan dengan 3-4 daun dan tinggi 3-5 cm digunakan sebagai sumber eksplan Gambar 3.3. Percobaan menggunakan
Rancangan Acak Kelompok RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga jenis eksplan [TP ± 0.3 mm, TL ± 2 mm, dan DP ±
4 mm] dan faktor kedua adalah tiga kultivar Dendrobium [D. ‘Gradita 10’, D.
Indonesia Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’]. Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 270 satuan percobaan sebagai satuan amatan. Setiap
satu eksplan dikulturkan dalam botol kultur Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm berisi 2.5 mL media semi-solid IM-3 medium ½ MS + 1.5 mg L
-1
TDZ + 0.5 mg L
-1
BA + 20 g L
-1
sukrosa + 2 g L
-1
gelrite dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi pada kondisi terang hingga terbentuk KE.
3.2.4.2 Pengaruh Kultivar dan Sistem Kultur Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan sistem kultur yang paling sesuai untuk inisiasi KE Dendrobium. TP plantlet ± 0.3 mm digunakan sebagai sumber
eksplan. Percobaan menggunakan RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga kultivar Dendrobium [D.
‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’] dan faktor kedua adalah dua sistem kultur
padatsemi-solid dan cair. Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 180 satuan percobaan sebagai satuan amatan. Setiap satu eksplan
dikulturkan dalam botol kultur Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm berisi 2.5 mL media IM- 3 medium ½ MS + 1.5 mg L
-1
TDZ + 0.5 mg L
-1
BA+ 20 g L
-1
sukrosa dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi pada kondisi terang hingga terbentuk KE.
Khusus untuk kultur cair digoyang di atas orbital shaker dengan kecepatan ± 100 rpm Rachmawati et al. 2014.
3.2.4.3 Pengaruh Kultivar dan Kondisi Inkubasi Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan kondisi inkubasi terbaikpaling sesuai untuk inisiasi KE Dendrobium. TP plantlet ± 0.3 mm digunakan sebagai sumber
35
eksplan. Percobaan menggunakan RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga kultivar Dendrobium [D.
‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’] dan faktor kedua adalah dua kondisi kultur
[terang dan gelap] pada 23.5 ± 1.1
°
C. Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 180 satuan percobaan. Setiap satu eksplan dikulturkan dalam
botol kultur Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm berisi 2.5 mL media semi-solid IM-3 medium ½ MS + 1.5 mg L
-1
TDZ + 0.5 mg L
-1
BA+ 20 g L
-1
sukrosa + 2 g L
-1
gelrite dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi sesuai perlakuan.
3.2.4.4 Pengaruh Kultivar dan Media Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan media teroptimasi untuk inisiasi KE Dendrobium
. Bahan tanaman yang digunakan adalah TP plantlet ± 0.3 mm. Percobaan menggunakan RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor
pertama adalah tiga kultivar Dendrobium [D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya
’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’] dan faktor kedua adalah delapan komposisi media IM Tabel 3.1. Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 720
satuan percobaan sebagai satuan amatan. Setiap satu eksplan dikulturkan dalam botol kultur Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm berisi 2.5 mL media semi-solid perlakuan
yang ditambah 20 g L
-1
sukrosa + 2 g L
-1
gelrite dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi pada kondisi terang hingga terbentuk KE.
Tabel 3.1. Komposisi media untuk inisiasi KE Dendrobium Media inisiasi
IM Media dasar
Zat pengatur tumbuh mg L
-1
TDZ BAP
Kinetin IM-1
½ MS 1.0
0.5 -
IM-2 ½ MS
1.0 1.0
- IM-3
½ MS 1.5
0.5 -
IM-4 ½ MS
1.5 1.0
- IM-5
VW 2.0
- 1.0
IM-6 VW
2.0 -
0.5 IM-7
VW 1.0
- 1.0
IM-8 VW
1.0 -
0.5
Media ½ MS ½ unsur makro dan mikro dengan vitamin penuh : 100 mg L
-1
myo-inositol, 0.1 mg L
-1
thiamine-HCl, 0.5 mg L
-1
Pyridoxine HCl, 0.5 mg L
-1
Nicotinic Acid, 2 mg L
-1
glycine Modifikasi Murashige Skoog 1962; VW Vacin Went 1949.
3.2.5 Peubah Pengamatan
Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah : 1 waktu inisiasi KE hari setelah kulturhsk, 2 kemampuan regenerasi eksplan , 3 persentase
KE , 4 bobot basah KE g, dan 5 volume KE mm
3
. Pengamatan berkala dilakukan untuk memantau perubahan eksplan dalam merespon media kultur
hingga pembentukan KE selama inkubasi. Waktu inisiasi KE dihitung dari awal eksplan dikulturkan hingga terbentuk KE. Persentase regenerasi eksplan dan
pembentukan KE dihitung dengan menghitung jumlah eksplan yang beregenerasi dan membentuk KE dibagi dengan total eksplan yang dikulturkan dikalikan
dengan 100 dan diamati 4 minggu setelah inkubasi. Bobot basah dan volume KE diukur satu bulan sejak KE terinisiasi.
36
3.2.6 Analisis Data
Data yang terkumpul dari setiap tahapan penelitian dianalisis menggunakan analysis of varian anova dengan pengolah data SAS Release Window 9.12.
Adanya perbedaan nyata nilai rata-rata perlakuan diuji lebih lanjut menggunakan Duncan’s New Multiple Range Test DMRT taraf kepercayaan 95 Mattjik
Sumertajaya 2006. Data ditampilkan dalam bentuk tabel dan grafik.
3.3 Hasil dan Pembahasan 3.3.1 Hasil Penelitian
Hasil pengamatan secara periodik yang diperkuat dengan hasil histologi jaringan menunjukkan bahwa secara umum inisiasi KE pada Dendrobium diawali
1 dengan pencoklatan eksplan tunas pucuk plantlet, 2 pembengkakan dan pencoklatan eksplan daun plantlet, danatau 3 pecahnya mata tunas lateral yang
diikuti oleh terjadinya pembelahan sel yang kemudian menginduksi pertumbuhan kalus yang tidak teratur. Kalus selanjutnya terpolarisasi dan berpotensi
membentuk sel embriogenik pada bagian permukaan jaringan eksplan Gambar 3.4 dan 3.5. Pada penelitian ini KE primer berhasil diinisiasi dari TP dan DP,
sedangkan KE danatau embrio somatik ES sekunder terinduksi pada TL Gambar 3.4 dan 3.5. Variasi respon inisiasi KE dengan kisaran yang luas
ditunjukkan oleh kombinasi kultivar dengan perlakuan lain. Inisiasi KE terjadi pada kisaran waktu 8.29-50.10 hari setelah inkubasi, dengan keberhasilan
regenerasi eksplan sebesar 38.7-99.6, 27.6-92.8 pembentukan KE, 0.16-0.36 g bobot KE dengan ukuran KE 1.55-3.81 mm
3
, dan 12.2-37.6 pencoklatan.
A. Inisiasi KE primer pada eksplan TP ± 9.5 hari setelah kultur; hsk, B. Inisiasi KE dan ES sekunder pada eksplan TL ± 15.5 hsk, dan C. Inisiasi KE primer pada eksplan DP ± 50 hsk.
TP: tunas pucuk; DP: daun plantlet; TL: tunas lateral; KE: kalus embriogenik; ES: embrio somatik.
Gambar 3.4. Inisiasi kalus embriogenik danatau embrio somatik pada tiga jenis eksplan Dendrobium.
A
B
C
37
A. Inisiasi KEp pada eksplan TP ± 9.5 hari setelah kultur; hsk, B. Inisiasi KEp pada eksplan DP ± 50 hsk, dan C. Inisiasi KEs dan ESs pada eksplan TL ± 15.5 hsk. TP: tunas pucuk; DP:
daun plantlet; TL: tunas lateral; KEp: KE primer; KEs: KE sekunder; ESs: embrio somatik sekunder.
Gambar 3.5. Histologi inisiasi kalus embriogenik danatau embrio somatik pada tiga jenis eksplan Dendrobium.
Pengamatan histologi menunjukkan kalus yang membentuk sel-sel merismatik yang rapat dikenal sebagai Proembryogenic mass PEMKE dengan
ciri-ciri: sel berukuran kecil, dinding selnya tipis, isodiometrik, sitoplasma rapat, inti sel besar dan jelas, vakuola kecil, mengandung butir pati, ruang antar sel lebih
rapat, berkelompokagregat, menyerap warna kuat, dan aktivitas pembelahan sel tinggi Arnold et al. 2002; Fu et al. 2012. Terdapatnya sel-sel yang isodiametris
dan merismatik yang kemudian membentuk agregat PEMKE mengindikasikan dimulainya tahapan inisiasi embriogenesis somatik. Sel-sel ini akan berkembang
menjadi embrio globular KEp dan KEs; Gambar 3.5A, 3.5B, dan 3.5C.
3.3.1.1 Pengaruh Kultivar dan Jenis Eksplan Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Hasil penelitian ini mengungkapkan bahwa perbedaan kultivar dan jenis eksplan berpengaruh nyata terhadap inisiasi KE, namun tidak terdapat pengaruh
interaksi yang nyata dari kedua perlakuan tersebut. Tiga kultivar yang diuji menunjukkan bahwa D.
Indonesia Raya ‘Ina’ merupakan kultivar yang memiliki respon terbaik pada semua peubah yang diamati, meski pengaruhnya tidak
berbeda nyata jika dibandingkan dengan D. Sonia ‘Earsakul’. Kultivar tersebut
walaupun waktu inisiasi KE lebih lambat dibanding pada D. Sonia ‘Earsakul’,
namun menunjukkan kemampuan regenerasi tertinggi hingga 89.1 dengan 87.5 KE, 0.28 g bobot basah dan 3.15 mm
3
ukuran KE Gambar 3.2. Sementara dari 3 jenis eksplan yang diuji, TP merupakan jenis eksplan yang paling sesuai
untuk inisiasi KE dibanding TL dan DP. Jenis eksplan ini menunjukkan waktu inisiasi KE terpendek hingga 9.5 hari setelah kultur dengan 98.2 kemampuan
regenerasi, 89.0 KE, 0.33 g bobot basah dan 3.4 mm
3
ukuran KE Tabel 3.2. Sedangkan respon terendah dalam inisiasi KE ditunjukkan oleh D.
‘Gradita 10’ dan DP sebagai sumber eksplan.