Vitamin B
12
secara perlahan rusak oleh asam encer, alkali, cahaya dan bahan-bahan pengoksidasi dan pereduksi. Pada pemasakan, kurang lebih 70
vitamin B
12
dapat dipertahankan. Dalam keadaan normal sebanyak ± 70 vitamin B
12
yang dikonsumsi dapat diserap oleh tubuh. Vitamin B
12
diperlukan untuk mengubah folat menjadi bentuk aktif dan memperlancar proses metabolisme.
Vitamin B
12
juga merupakan kofaktor dua jenis enzim pada manusia, yaitu metionin sintetase dan metilmalonil-Ko A mutase. Gejala kekurangan vitamin B
12
ditandai dengan anemia. Kekurangan vitamin B
12
dapat menimbulkan dua jenis sindroma, yaitu sindroma berupa gangguan sintesis DNA yang menyebabkan
gangguan perkembangbiakan sel dan sindroma berupa gangguan saraf yang menunjukkan degenerasi otak, saraf mata, saraf tulang belakang, dan saraf perifer
Almatsier 2006.
2.3.2 High Performance Liquid Chromatography HPLC
High Performance Liquid Chromatography HPLC adalah kromatografi yang dikembangkan menggunakan cairan sebagai fase gerak baik cairan polar
maupun non polar, dan bekerja pada tekanan tinggi Adnan 1997. Dalam kromatografi partisi cair baik fase stasioner maupun fase mobil berupa cairan.
Pelarut yang digunakan harus tidak dapat bercampur. Perlarut yang lebih polar biasanya digunakan sebagai fase stasioner, oleh karena itu sistem ini dinamakan
kromatografi fase normal normal phase chromatography. Bila fase stasioner yang dipakai senyawa non polar, sedangkan fase mobilnya polar atau terbalik
dengan sistem fase normal maka sistemnya disebut kromatografi fase reverse phase chromatography. Komponen utama alat yang dipakai dalam HPLC antara
lain 1 reservoir zat pelarut untuk fase gerak; 2 pompa; 3 injektor; 4 kolom; 5 detektor dan 6 rekorder Adnan 1997.
Komposisi vitamin dapat ditentukan menggunakan HPLC Robinson et al. 2001. Penggunaan HPLC yang digabungkan dengan detektor flourimetrik
memungkinkan sebagai metode khusus dan sensitif yang dapat dikembangkan untuk penentuan beberapa vitamin dalam bahan makanan, diantara banyak metode
yang dianjurkan, vitamin merupakan yang paling sering diuji dalam bentuk bebas, meliputi hidrolisis dari bentuk fosforilase Ndaw et al. 2000.
Reservoir Pelarut
Zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari senyawa yang dianalisis. Hal yang harus diperhatikan adalah tempat pelarut
tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut tersebut. Cara yang dipakai dapat bermacam-macam, misalnya
dengan pemanasan, perlakuan vakum, atau dengan mengalirkan gas yang bersifat inert seperti helium Adnan 1997.
Menghilangkan gas atau udara dalam pelarut yang dipakai sebagai fase gerak penting, karena pada waktu dialirkan dengan pompa, aliran fase gerak dapat
terbentuk gelembung gas, sehingga dapat menyebabkan aliran menjadi diskontinyu dan dapat mengganggu kromatogram yang dihasilkan Adnan 1997.
Pompa
Pompa diperlukan sebagai fase gerak dengan kecepatan dan tekanan yang tetap. Tatanan yang diperlukan tergantung dari ukuran kolom dan viskositas dari
pelarut. Pada kolom yang umum dipakai, yaitu berdiameter 5 mm dengan kecepatan aliran 1-2 mlmenit dan tekanan yang diperlukan mencapai 400 bar.
Sistem pompa pada HPLC telah diprogram untuk dapat melakukan elusi dengan satu atau dua lebih macam pelarut. Ada dua teknik elusi yang digunakan dalam
HPLC, yaitu : 1
teknik isokratik, merupakan teknik elusi dengan komposisi fase gerak yang tidak berubah selama analisis berlangsung sehingga polaritas fase
geraknya tetap. 2
teknik elusi gradien, merupakan teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak yang berubah secara periodik, umumnya digunakan untuk contoh
yang mengandung
komponen dengan
polaritas berbeda-beda
Adnan 1997.
Injektor
Pada waktu sampel disuntikkan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom.
Sampel dapat langsung disuntikkan ke dalam kolom atau digunakan katup injeksi, dimana sampel diinjeksi ke dalam holding loop. Aliran pelarut dari pompa
kemudian dialirkan melalui loop yang seterusnya akan mendesak sampel masuk ke ujung kolom Adnan 1997.
Kolom
kolom merupakan jantung atau inti dari keseluruhan peralatan kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis tergatung pada pilihan kolom
dan kondisi kerja, karena pemisahan komponen analit terjadi pada kolom. Berdasarkan jenis fase diam dan fase geraknya, kolom terbagi menjadi dua, yaitu
fase normal dan fase terbalik. Fase normal jika fase diamnya lebih polar dari fase geraknya, sebaliknya fase terbalik jika fase geraknya lebih polar dari fase diamnya
Gritter et al. 1991.
Detektor
Cairan fase gerak yang keluar dari kolom langsung dialirkan ke detektor untuk dideteksi komponen-komponennya. Pendeteksian ini berguna untuk
menentukan komponen-komponen dalam sampel baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa persyaratan detektor, yaitu memiliki sensitifitas tinggi,
stabil, memiliki reprodusibilitas yang baik, dapat bekerja pada suhu kamar sampai 400
o
C, dan tidak terpengaruh oleh perubahan suhu dan kecepatan pelarut pengembang, serta tidak merusak contoh Gritter et al. 1991.
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
