digunakan dalam uji ALT adalah Plate Count Agar PCA dengan metode yang mengacu pada Metode Analisis Mikrobiologi Tahun 2006
MA PPOMN nomor 96mik00. c.
Uji identifikasi Escherichia coli adalah serangkaian uji untuk mengidentifikasi bakteri E.coli yang terdapat pada jamu pahitan
brotowali, sehingga dapat diketahui ada atau tidaknya keberadaan E.coli pada jamu pahitan brotowali. Uji yang dilakukan antara lain uji
pengkayaan, isolasi, uji biokimia fermentasi glukosa, fermentasi laktosa, fermentasi manitol, fermentasi maltosa, fermentasi sukrosa, uji
indol, uji metil merah, uji voges proskauer, uji sitrat, serta uji konfirmasi keberadaan E.coli dengan pengecatan gram. Serangkaian uji
identifikasi E.coli
tersebut mengacu
pada Metode
Analisis Mikrobiologi Tahun 2006 MA PPOMN nomor 96mik00.
C. Bahan Penelitian
Bahan utama yang digunakan adalah jamu pahitan brotowali yang dijual oleh penjual jamu gendong keliling di wilayah Tonggalan, Klaten Tengah. Bahan
kimia yang digunakan adalah media Plate Count Agar PCA, Tryptone Broth TB, Methyl Voges Proskauer MR-
VP, Simmon’s Citrate Agar SCA, PDF Pepton Dilution Fluid, aquadest steril, etanol 70, pereaksi indol, larutan metil
merah, larutan α-naftol, larutan KOH 40, larutan gula-gula glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sukrosa, Kontrol positif E.coli ATCC 25922, Tryptone Bile-
Glucoronide TBX, Media E.coli Broth ECB, larutan crystal violet-ammonium oksalat, larutan lugol garam iodine, alkohol 95.
D. Alat penelitian
Laminar Air Flow E-Scientific, autoklaf model KT-40 No.108049 Midorigaoka Japan, inkubator WTC binder, oven Memmert model 400,
stomacher 400 circulator Seward, mikropipet Iwaki, mikroskop, pipet tetes, tabung reaksi Pyrex, tabung Durham, gelas sediaan, cawan petri 100 x 15 mm,
pipet volume, beaker glass Pyrex, gelas ukur Pyrex, bunsen, neraca analitik Precition Balance Model AB-204, Metter Taledo, erlenmeyer, penangas air, jarum
ose, colony counter Model CC-1, Boeco.
E. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan sampel
Sampel jamu yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari 3 penjual jamu gendong keliling di wilayah Tonggalan Klaten Tengah. Masing-masing dari
penjual jamu diambil 3 sampel jamu pahitan brotowali sehingga total jamu yang diambil sebanyak 9 sampel. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak satu kali
yaitu pada tanggal 19 Oktober 2015 pada pukul 06.00 WIB. 2.
Penanganan wadahkemasan penyiapan sampel Sampel jamu pahitan brotowali dari penjual jamu dipindahkkan kedalam botol
kaca steril dan ditutup rapat, kemudian seluruh sampel jamu dalam botol steril dimasukkan kedalam coolbox untuk dibawa ke laboratorium. Sebelum melakukan
proses pengujian, sumbat atau tutup botol steril berisi sampel jamu pahitan brotowali dibersihkan dengan kapas beralkohol 70, lalu dipanaskan pada api
bunsen sebentar. Sumbat dibuka dan sampel jamu dapat diambil dari botol steril secara aseptis yaitu dekat pada api bunsen.
3. Tahap Pra-Pengkayaan
a. Homogenisasi sampel untuk uji ALT
Sampel jamu pahitan brotowali dipipet 25 mL secara aseptis, selanjutnya dimasukkan kedalam plastik steril yang telah berisi 225 mL larutan pengencer
PDF, lalu dihomogenkan dengan bantuan Stomacher sehingga diperoleh pengenceran 10
-1
. b.
Pengenceran sampel untuk uji ALT Larutan pengencer PDF dimasukkan ke dalam 5 buah labu ukur 10 mL dengan
masing-masing labu ukur sebanyak 9 mL. Pengenceran 10
-1
dari hasil homogenisasi pada penyiapan sampel dipipet 1 mL dengan cara aseptis dan
dimasukkan ke dalam tabung pertama yang telah diisi sebanyak 9 mL PDF hingga diperoleh pengenceran 10
-2
, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Pengenceran selanjutnya dibuat hingga 10
-6
. 4.
Uji ALT a.
Pembuatan media Plate Count Agar PCA PCA ditimbang hingga diperoleh 7,05 g dan dicampurkan dengan 300 mL
aquadest steril, pH diatur 7,0 dan dipanaskan hingga larutan jernih. Langkah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
selanjutnya adalah PCA disterilkan menggunakan autoclaf selama 15 menit pada suhu 121
O
C. b.
Uji ALT Pengenceran sampel yang telah dibuat sebelumnya dipipet masing-
masing 1 mL secara aseptis kedalam cawan petri steril dan dibuat duplo. Media PCA sebanyak 15 mL yang telah dicairkan yang bersuhu 45±1
o
C dalam waktu 15 menit dari pengenceran pertama dituangkan pada setiap
cawan petri. Cawan petri digoyangkan secara perlahan agar sampel tersebar merata pada media dan biarkan hingga memadat. Uji kontrol dilakukan untuk
mengetahui sterilitas media dan pengencer. Uji sterilitas media dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dalam suatu cawan petri dan dibiarkan
memadat. Uji sterilitas pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PCA yang ditambahkan sebanyak 1 mL pengencer PDF lalu dibiarkan
memadat. Seluruh cawan petri diinkubasi terbalik pada suhu 35
o
C selama 24 jam hingga 48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Dihitung
Angka Lempeng Total dalam 1 mL contoh dengan mengalikan jumlah rata- rata koloni pada cawan dengan faktor pengenceran yang digunakan PPOMN,
2006. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Uji Identifikasi Escherichia coli
a. Uji pengkayaan
Suspensi hasil homogenisasi contoh dipipet sebanyak 1 mL dan diinokulasikan pada 9 mL ECB. Kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Timbulnya gas pada tabung Durham dan kekeruhan pada media yang
menunjukkan karakteristik E.coli PPOMN, 2006. b.
Isolasi Hasil dari biakan pengkayaan diinokulasikan pada permukaan TBX
dengan cara streak plate dan diinkubasi dengan posisi lempeng terbalik pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Koloni spesifik E.coli yang tumbuh dengan ciri- ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm, berwarna hijau dengan kilap logam dan
bintik biru kehijauan ditengahnya PPOMN, 2006. c.
Identifikasi E.coli dengan uji biokimia Satu koloni spesifik dipilih pada media TBX dan ditanam pada media
fermentasi karbohidrat, media SIM, media MR-VP , dan media Simmon’s
Citrate Agar kemudian diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam sebagai berikut :
1 Uji fermentasi glukosa
Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada media glukosa dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna
media dari orange kemerahan menjadi kuning. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2 Uji fermentasi laktosa
Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada media laktosa dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna
media dari orange menjadi kuning. 3
Uji fermentasi manitol Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan
diinokulasikan pada media manitol dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna
media dari orange kemerahan menjadi kuning. 4
Uji fermentasi maltosa Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan
diinokulasikan pada media maltosa dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna
media dari orange kemerahan menjadi kuning. 5
Uji fermentasi sukrosa Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan
diinokulasikan pada media maltosa dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam diinokulasikan pada media sukrosa dan diinkubasi pada
suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange menjadi kuning.
6 Uji Indol
Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada media SIM dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, ditambahkan 1 mL pereaksi indol Reagen
kovacs ke dalam masing-masing tabung dan dikocok beberapa menit. Warna merah muda yang membentuk cincin pada permukaan biakan
menunjukkan reaksi indol positif. 7
Uji Metil Merah Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan
diinokulasikan pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 48 jam. Setelah diinkubasi ditambahkan 5 tetes larutan metil merah
dan dikocok hingga homogen selama beberapa menit. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif dan warna merah menunjukkan reaksi positif.
8 Uji Voges Proskauer
Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 48 jam. Ditambahkan 12 tetes larutan alfanaftol dan 4 tetes larutan
KOH 40, dikocok kemudian didiamkan selama 2-4 jam. Perubahan warna biakan menjadi merah muda hingga merah menyala menunjukkan
reaksi positif. 9
Uji Sitrat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Biakan pada media TBX hasil dari uji isolasi diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada media Simmon’s Citrate Agar dan diinkubasi pada
suhu 35-37
o
C selama 48 jam. Perubahan warna media dari hijau menjadi biru menunjukkan reaksi positif.
d. Uji konfirmasi keberadaan E.coli dengan pengecatan gram
Sediaan berupa hasil biakan dari uji isolasi pada media TBX yang diambil 1 sengkelit dan digoreskan di atas kaca preparat, kemudian sediaan
dikeringkan di udara dan difiksasikan dengan panas. Sediaan diwarnai dengan larutan crystal violet-ammonium oksalat selama 1 menit, selanjutnya sediaan
dicuci dengan air dan ditiriskan. Larutan lugol garam iodine dibubuhkan dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan air dan
ditiriskan. Warna dihilangkan dengan dicuci menggunakan alkohol 95 selama 30 detik. Sediaan dicuci dengan air dan ditiriskan. Sediaan diserap
dengan kertas saring, dikeringkan dan dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 1000 kali PPOMN, 2006.
F. Analisis Hasil
