III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan ITP Fakultas Teknologi Pertanian dan Laboratorium South East Asian
Food Agricultural Science Technology SEAFAST Centre Institut Pertanian
Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Mei sampai dengan November 2009.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah pisang meliputi pisang kepok, siam, uli dan tanduk. Buah pisang yang digunakan adalah
buah yang sudah tua tetapi belum matang dengan kulit yang masih berwarna hijau. Tiga jenis pisang kepok, siam dan uli diperoleh dari pasar leuwiliang-
Bogor, sedangkan pisang tanduk diperoleh dari daerah Lumajang-Jawa Timur. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah enzim a-amilase, enzim
pankreatin, AMG Amiloglukosidase A7095-Sigma, NaOH 1 M, HCl, buffer asetat, buffer Na-fosfat 0.05 M dan 0.1 M pH 7, 3.5- dinitrosalisilat DNS,
buffer fosfat 0.08 M, asam format, NaOH, NaCl, CaCO
3
, KOH, iodin, akuades, akuades deionisasi, etanol 70, 80, dan 95, aseton, asam asetat, Na
2
SO
4
- HgO, Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O, petroleum eter, Na-K-tartarat, media MRS agar Oxoid, plate count agar
PCA Merck, starch agar Difco, m-MRSB pepton, ekstrak khamir, sodium asetat, MgSO4, MnSO4, dan dipotasium fosfat dan bahan kimia
lainnya. Isolat bakteri asam laktat yang digunakan terdiri dari Lactobacillus
plantarum sa28k koleksi Lab Mikrobiologi Pangan-ITP, Lactobacillus
acidophillus koleksi Lab Mikrobiologi Pangan-SEAFAST dan Lactobacillus
fermentum 2B4 koleksi Lab Mikrobiologi-FAPET yang ditumbuhkan dalam
media MRSB. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, otoklaf Model MC-40, inkubator, lemari pendingin, oven, sentrifuse,
spektrofotometer, pH meter, waterbath shaker, mikropipet, dan alat-alat gelas untuk analisis kimia dan mikrobiologi lainnya.
3.3. Tahapan Penelitian 3.3.1. Seleksi Jenis Pisang
Dari empat jenis pisang yang diteliti, dipilih satu jenis pisang berdasarkan kadar pati dan amilosa dari tepung pisang. Tepung pisang dipersiapkan sebagai
berikut: buah pisang diiris tipis membentuk lembaran setebal ± 6 mm irisan pisang, selanjutnya irisan pisang dikeringkan dengan sinar matahari hingga kadar
air sekitar 12 SNI 1997. Irisan pisang yang telah kering chips pisang dihaluskan dengan menggunakan gilingan cakram disc mill dan diayak
menggunakan saringan berukuran mesh 80. Tepung pisang selanjutnya dianalisis kadar pati, amilosa, daya cerna in vitro, kadar serat pangan, kadar pati resisten dan
derajat putihnya.
3.3.2. Perubahan Mikroflora dan Sifat Kimia Selama Fermentasi Spontan
Irisan pisang direndam dalam akuades steril dengan perbandingan bahan dan air sebesar 1:2 200 g irisan pisang:400 ml akuades steril. Inkubasi dilakukan
pada suhu ruang ±27°C selama 20, 40, 60, 80 dan 100 jam. Pada setiap interval waktu pada cairan fermentasi dilakukan pengukuran terhadap nilai pH, jumlah
total bakteri mesofilik, total bakteri asam laktat dan total mikroba amilolitik. Irisan pisang dari masing-masing waktu fermentasi spontan selanjutnya
dikeringkan di bawah sinar matahari hingga kadar air sekitar 12, dihaluskan dan diayak dengan saringan ukuran 80 mesh, selanjutnya diukur kadar amilosa dan
patinya. Lama fermentasi spontan ditentukan berdasarkan nilai pH, pertumbuhan mikroorganisme total bakteri mesofilik, bakteri asam laktat dan mikroba
amilolitik, kadar pati dan amilosa.
3.3.3. Modifikasi Tepung Pisang Melalui Kombinasi Fermentasi Spontan dan Satu Siklus Pemanasan Otoklaf
Irisan pisang dengan lama waktu fermentasi spontan terpilih, kemudian dipisahkan dari cairan fermentasinya penirisan, selanjutnya irisan pisang
dipanaskan dalam otoklaf 0.15 MPa atau 1.5 Atm pada suhu 121°C selama 15 menit, didiamkan pada suhu ruang hingga dingin ±30 menit dan disimpan
pada suhu 4°C selama 24 jam satu proses siklus. Selanjutnya irisan pisang dikeringkan di bawah sinar matahari hingga kadar air sekitar 12, dihaluskan dan
diayak menggunakan saringan berukuran 80 mesh. Tepung pisang yang dihasilkan dianalisis terhadap kadar pati, amilosa, pati resisten, serat pangan total dan daya
cerna pati in vitro. Tepung pisang dengan kadar pati resisten tertinggi kemudian diuji potensi prebiotiknya. Tahapan modifikasi tepung pisang melalui kombinasi
fermentasi spontan dan satu siklus pemanasan otoklaf dapat dilihat pada Gambar 1.
3.3.4. Modifikasi Tepung Pisang Melalui Pemanasan Otoklaf Berulang Alejandro Aparicio-Saguilan
et al. 2005
Irisan pisang dimodifikasi patinya dengan pemanasan otoklaf 0.15 MPa atau 1.5 Atm pada suhu 121°C selama 15 menit, didiamkan pada suhu ruang
hingga dingin ±30 menit dan disimpan pada suhu 4°C selama 24 jam. Siklus otoklaf dan pendinginan ini diulang dua dan tiga siklus untuk melihat
pengaruhnya terhadap pembentukan pati resisten. Selanjutnya irisan pisang dikeringkan di bawah sinar matahari hingga kadar air sekitar 12. Irisan pisang
kering dihaluskan menggunakan gilingan cakram disc mill dan diayak menggunakan saringan berukuran 80 mesh.
Tepung pisang yang dihasilkan kemudian diukur kadar pati, amilosa, pati resisten, daya cerna pati in vitro dan serat pangan totalnya. Tepung pisang hasil
perlakuan satu siklus pemanasan otoklaf kemudian diuji viabilitas bakteri asam laktatnya.
Pengukuran kadar pati resisten, pati, amilosa, daya cerna pati in vitro, serat pangan total dan
uji viabilitas bakteri asam laktat kandidat probiotik Gambar 1 Pembuatan tepung pisang modifikasi kombinasi fermentasi dan satu
siklus pemanasan otoklaf
Pisang tanduk
Pengirisan pisang irisan pisang dengan tebal ± 6 mm
Perendaman irisan pisang dalam air 1:2
Fermentasi pada suhu kamar lama fermentasi terpilih
Pemanasan otoklaf 121ºC,15 menit dan
retrogradasi 4ºC, 24 jam
Pengeringan dan penepungan 80 mesh Penirisan cairan fermentasi
3.4 Analisis Fisikokimia 3.4.1. Persiapan Sampel Tepung Pisang Bebas Lemak dan Gula Sederhana
Sebanyak tiga gram tepung pisang dicuci dengan menggunakan etanol 80 sebanyak ± 30 ml secara maserasi untuk menghilangkan gula-gula sederhana
pada suhu kamar selama 15 menit. Suspensi disaring dengan kertas saring dan residu dicuci dengan akuades sampai volume filtrat mencapai 250 ml. Residu
kertas saring dicuci 5 kali dengan 10 ml eter untuk menghilangkan lemak. Selanjutnya sampel dibiarkan untuk menguapkan eter dari residu dan dicuci lagi
dengan 150 ml alkohol 10 untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. Residu pada kertas saring kemudian dikeringkan dengan menggunakan
sinar matahari selama 3-4 jam. Tepung pisang bebas lemak dan gula sederhana ini, selanjutnya digunakan dalam analisis kadar total pati, kadar amilosa, kadar
pati resisten dan uji viabilitas bakteri asam laktat.
3.4.2. Kadar Pati Resisten Englyst et al. 1992
Sebanyak satu gram tepung pisang modifikasi yang telah bebas lemak dan gula sederhana didispersikan ke dalam 20 ml buffer sodium asetat 0.1 M; pH 5.2
dipanaskan dalam water bath selama 30 menit. Dispersi pati didinginkan pada suhu 37°C, dicampur dengan larutan enzim 5 ml yang terdiri dari ekstrak
pankreatin dan amiloglukosidase AMG, lalu diinkubasi pada water bath suhu 37°C.
Ekstrak pankreatin diperoleh dari : 3 g pankreatin disuspensikan dalam 20 ml air deionisasi destilata, distirer selama 10 menit pada suhu ruang, dan
disentrifuse pada 1500xg selama 10 menit. Larutan enzim dipersiapkan dengan mencampurkan 13.5 ml supernatan ekstrak pankreatin, 210 U amiloglukosidase,
dan 1 ml air deionisasi. Pati yang cepat dicerna RDS dinyatakan sebagai total pati yang dicerna selama 20 menit pertama, dan pati yang lambat dicerna SDS,
dinyatakan sebagai total yang dicerna antara 20 dan 120 menit. Dispersi pati kemudian ditambahkan KOH pekat 10 M, dan disimpan selama 15 menit pada
suhu 0ºC, kemudian ditambahkan AMG dan dipanaskan pada suhu 70ºC selama 30 menit RS.
Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air dengan suhu air 100
°
C selama 10 menit lalu didinginkan pada suhu ruang. Sampel kemudian diencerkan dengan penambahan
10 ml akuades dan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Akuades digunakan sebagai blanko.
Kurva standar dibuat menggunakan larutan glukosa standar dengan larutan glukosa 5000 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja yang digunakan sebagai
standar adalah 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2000 ppm, 2500 ppm, 3000 ppm, 3500 ppm, 4000 ppm, 4500 ppm, dan 5000 ppm. Berat pati diperoleh dengan
mengalikan berat glukosa dengan faktor koreksi 0.9. Kadar pati resisten RS dihitung berdasarkan persamaan :
Pati resisten = A x FP x 100 x 0.9 S W
Keterangan : A : absorbansi sampel
S : slopekemiringan kurva standar FP : faktor pengenceran
W : berat sampel gram
3.4.3. Kadar Pati AOAC 1995
Analisis kadar pati dengan metode hidrolisis langsung oleh asam Direct Acid Hydrolysis
. Sebanyak 0.5 g sampel tepung pisang yang telah bebas lemak dan gula-gula sederhana ditimbang dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Lalu
ditambahkan 25 ml akuades dan 5 ml HCl 25. Erlenmeyer ditutup dengan pendingin balik dan dipanaskan di atas penangas air yang mendidih selama 2.5
jam. Setelah dingin larutan yang terbentuk dinetralkan dengan NaOH 25, disaring, dan ditepatkan volumenya hingga 100 ml. Penentuan kadar pati
dinyatakan sebagai glukosa pada filtrat. Total glukosa dianalisis dengan menggunakan metode DNS.
Sampel yang telah dihidrolisis dengan asam, dinetralkan, disaring dan ditepatkan hingga volume 100 ml diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke
dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dipanaskan dalam waterbath suhu air mendidih selama 10 menit lalu didinginkan
pada suhu ruang. Sampel kemudian diencerkan dengan penambahan 10 ml akuades dan absorbansi diukur pada panjang gelombang 550 nm. Gunakan sampel
akuades sebagai blanko. Kurva standar dibuat menggunakan larutan glukosa standar dengan larutan glukosa 5000 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja
yang digunakan sebagai standar adalah 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2000 ppm, 2500 ppm, 3000 ppm, 3500 ppm, 4000 ppm, 4500 ppm, dan 5000 ppm.
Berat pati diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan faktor koreksi 0.9. Kadar glukosa dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Pati = A x FP x 100 x 0.9 S W
Keterangan : A : absorbansi sampel
S : slopekemiringan kurva FP : faktor pengenceran
W : berat sampel gram
3.4.4. Kadar Amilosa Juliano 1971 3.4.4.1. Pembuatan Kurva Standar
Amilosa murni sebanyak 40 mg dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan dengan 1 ml etanol 95 dan 9 ml NaOH 1 N lalu dipanaskan
dalam penangas air suhu 95ºC selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel pati dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 100 ml dan ditepatkan
sampai tanda tera dengan akuades menjadi larutan stok standar. Selanjutnya larutan tersebut dipipet masing-masing sebanyak 1, 2, 3, 4,
dan 5 ml lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Ke dalam masing-masing labu ukur tersebut ditambahkan asam asetat 1 N sebanyak masing-masing 0.2; 0.4;
0.6; 0.8; dan 1 ml, lalu ditambah larutan iod sebanyak 2 ml 0.2 g I
2
dan 2 g KI dilarutkan dalam 100 ml akuades ke dalam setiap labu. Setelah itu, larutan
ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades, dikocok, dan didiamkan selama 20
menit, lalu diukur intensitas warna yang terbentuk dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm. Kurva standar merupakan hubungan antara kadar
amilosa dan absorbansi.
3.4.4.2. Pengukuran Sampel
Sebanyak 100 mg sampel tepung pisang bebas lemak dan gula-gula sederhana dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup dan ditambahkan dengan
1 ml etanol 95 dan 9 ml NaOH 1 N. Tabung reaksi bertutup lalu dipanaskan dalam penangas air suhu 95ºC selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel
pati dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 100 ml dan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades. Pipet 5 ml larutan tersebut, lalu dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 ml, dan ditambahkan 1 ml asam asetat 1 N dan 2 ml larutan iod.
Selanjutnya larutan ditera dengan akuades sampai tanda batas dan dikocok kemudian didiamkan selama 20 menit. Intensitas warna diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm. Kadar amilosa ditentukan berdasarkan persamaan kurva yang diperoleh. Kadar amilopektin dihitung
berdasarkan selisih antara kadar pati dan amilosa. Kadar amilosa sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut:
kadar amilosa = A x FP x V x 100 S W
Keterangan : A : absorbansi sampel
S : slopekemiringan kurva FP : faktor pengenceran
V : volume akhir sampel ml W : berat sampel mg
3.4.5. Kadar Serat Pangan Metode Enzimatis AOAC 1995
Tiga gram sampel kering diekstrak lemaknya dengan pelarut petroleum eter sebanyak ±25 ml pada suhu kamar selama 15 menit. Sejumlah 1 g sampel
bebas lemak dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer fosfat pH 6 dan dibuat suspensi. Selanjutnya suspensi sampel ditambahkan
0.1 ml termamyl, ditutup dengan alufo dan diinkubasi pada suhu 100º C selama 15 menit, lalu didinginkan. Setelah itu, tambahkan 20 ml akuades dan pH diatur
menjadi 1.5 dengan menambahkan HCL 4 M. Lalu ditambahkan 100 mg pepsin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40ºC dan diagitasi 60 menit. Kemudian,
ditambahkan 20 ml akuades dan pH diatur menjadi 6.8. Setelah itu, ditambahkan 100 mg pankreatin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40ºC selama 60 menit
sambil diagitasi dan terakhir pH diatur dengan HCL menjadi 4.5.
3.4.5.1. Pengukuran Serat Pangan Tidak Larut
Selanjutnya disaring dengan kertas saring Whatman No. 42 yang sebelumnya telah diketahui bobot keringnya kemudian sampel dicuci dengan 2 x
10 ml akuades, 2 x 10 ml etanol 95 dan 2 x 10 ml aseton, lalu dikeringkan pada suhu 105º C sampai berat tetap sekitar 12 jam dan ditimbang setelah didinginkan
dalam desikator D1. Kemudian diabukan dalam tanur 500ºC selama minimal 5 jam dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator L1. Nilai blanko B
diperoleh dengan cara yang sama namun tanpa menggunakan sampel.
3.4.5.2. Pengukuran Serat Pangan Larut
Filtrat yang didapat dari persiapan sampel ditambahkan akuades hingga volumenya 100 ml. Filtrat kemudian ditambah etanol 95 dengan suhu 60ºC
sebanyak 400 ml, lalu diendapkan selama 1 jam. Filtrat disaring dan dicuci dengan 10 ml etanol 95 dan 10 ml aseton sebanyak 2 kali. Sampel dikeringkan
pada suhu 105ºC selama 24 jam, kemudian dimasukkan dalam desikator dan ditimbang D2. Sampel yang telah kering diabukan pada suhu 500ºC selama 5
jam, lalu dinginkan dalam desikator dan dtimbang L2. Nilai TDF bb = {D1-B1-L1-B2W x 100
bb serat pangan tidak larut = D1-L1-B1W x 100 bb serat pangan larut = D2-L2-B2W x 100
Keterangan : W : berat sampel g
B : berat banko bebas serat g D : berat setelah analisis dan dikeringkan g
L : berat setelah diabukan g
3.4.6. Uji Daya Cerna Pati in Vitro Anderson et al. 2002
Enzim a-amilase dilarutkan di dalam buffer Na-Fosfat 0.05 M pH 7. Pereaksi dinitrosalisilat dibuat dengan melarutkan 1 gram 3.5-dinitrosalisilat, 30
gram Na-K tartarat dan 1.6 gram NaOH dalam 100 ml akuades. Larutan maltosa standar yang digunakan adalah 0-10 mg masing-masing dalam 10 ml akuades.
Sebanyak 0.5 gram pati disuspensikan dalam 50 ml akuades sehingga diperoleh konsentrasi 1 wv, kemudian dipanaskan dalam penangas air selama 30 menit
pada suhu 90°C kemudian didinginkan. Sebanyak 2 ml sampel dipindahkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan
3 ml akuades, dan 5 ml buffer Na-Fosfat 0.1 M, pH 7. Lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan larutan a-amilase dan diinkubasi
lagi pada suhu 37°C selama 30 menit. Sebanyak 1 ml sampel dari tabung reaksi dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain, ditambah 2 ml pereaksi
dinitrosalisilat. Lalu dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Warna merah orange yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 520 nm. Kadar maltosa campuran reaksi dihitung dengan menggunakan kurva standar maltosa murni yang diperoleh dengan mereaksikan
larutan maltosa standar dengan pereaksi dinitrosalisilat menggunakan prosedur seperti di atas. Blanko dibuat untuk menghitung kadar maltosa awal bukan hasil
hidrolisis enzim. Prosedur pembuatan blanko sama seperti prosedur untuk sampel hanya saja tanpa sampel dan tidak ditambahkan larutan enzim a-amilase. Sebagai
gantinya untuk blanko diganti buffer Na-Fosfat 0.1 M pH 7. Daya cerna pati = Kadar maltosa sampel-kadar maltosa blanko sampel x 100
Kadar maltosa pati murni-kadar maltosa blanko pati murni
3.4.7 Pengukuran pH
pH meter dikalibrasi dengan menggunakan buffer fosfat pH 4 dan pH 7. Sampel dalam bentuk tepung sebanyak 1 g dilarutkan dalam 20 ml akuades,
kemudian diaduk sampai basah sempurna. Setelah itu, ukur pH pada supernatan sampel dengan menggunakan pH meter yang telah dikalibrasi terlebih dahulu.
Sampel dalam bentuk cairan, setelah dikalibrasi terlebih dahulu sampel dapat langsung diukur menggunakan pH meter.
3.4.8. Kadar Air, Metode Oven AOAC 1995
Cawan kosong dikeringkan dalam oven selama 15 menit, lalu didinginkan dalam desikator, dan ditimbang. Sebanyak 4-5 gram sampel ditimbang dalam
cawan yang telah diketahui bobot kosongnya, lalu dikeringkan dalam oven pengering suhu 105ºC selama 6 jam. Cawan dan isinya didinginkan dalam
desikator, lalu ditimbang. Pengeringan dilakukan kembali hingga diperoleh berat konstan. Kadar air dihitung berdasarkan kehilangan berat yaitu selisih berat awal
sampel sebelum dikeringkan dengan berat akhir setelah dikeringkan. Hasil analisis dari kadar pati resisten, pati, amilosa, daya cerna pati in vitro dan serat pangan
total ditampilkan dalam berat kering. Kadar air bk = W
3
x 100 W
2
Kadar air bb = W
3
x 100 W
1
Keterangan : W
1
= bobot sampel sebelum dikeringkan g W
2
= bobot sampel setelah dikeringkan g W
3
= W
1
-W
2
3.5. Analisis Mikrobiologi 3.5.1. Total Bakteri Mesofilik Modifikasi Lacerda
et al. 2005
Bakteri mesofilik dihitung dengan metode agar tuang menggunakan plate count agar
merk yang terdiri dari 5 tripton, 2.5 yeast ekstrak, 1 dekstros
dan 1.5 agar. Sampel sebanyak 10 ml diambil dan diencerkan dengan 90 ml larutan fisiologis 0.85 steril dan dilakukan pengenceran sampai 10
-8
. Sebanyak 1 ml hasil pengenceran 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
dipipet dan dilakukan pemupukan plating metode tuang pour plate pada media PCA. Inkubasi dilakukan pada suhu ±30°C
selama 2-3 hari serta dihitung jumlah koloni yang ada.
3.5.2. Total Mikroorganisme Amilolitik modifikasi Lacerda et al. 2005
Sampel sebanyak 10 ml diambil dan diencerkan dengan 90 ml larutan fisiologis 0.85 steril dan dilakukan pengenceran sampai 10
-8
. Sebanyak 1 ml hasil pengenceran 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
diambil dan dilakukan pemupukan plating metode tuang pour plate pada media Starch Agar difco yang terdiri dari 0.3
ekstrak daging beef extract, 1 pati terlarut soluble strach dan 1.2 agar. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar ±28°C selama 2-3 hari serta dihitung
jumlah koloni yang ada.
3.5.3. Total Bakteri Asam Laktat Bolognani et al. 2001
Sampel sebanyak 10 ml diambil dan diencerkan dengan 90 ml larutan fisiologis 0.85 steril dan dilakukan pengenceran sampai 10
-8
. Sebanyak 1 ml hasil pengenceran 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
diambil dan dilakukan pemupukan plating metode tuang pour plate pada media MRSA oxoid. Inkubasi dilakukan secara
aerob pada suhu 37°C selama 48 jam serta dihitung jumlah koloni yang ada.
3.5.4. Perhitungan Total Koloni BAM 2001
Merujuk pada penentuan Aerobic Plate Count BAM 2001, perhitungan koloni dilakukan setelah waktu inkubasi dalam satuan cfuml.
N = S c
n
1
+ 0,1 n
2
x d Keterangan :
N = Jumlah mikroba cfuml
Sc = Jumlah koloni dari semua cawan 25-250 koloni n
1
= Jumlah cawan pada pengenceran pertama 25-250 koloni n
2
= Jumlah cawan pada pengenceran kedua 25-250 koloni d = Tingkat pengenceran terendah
3.6. Pengujian Sifat Prebiotik Pati Resisten Tepung Pisang Modifkasi 3.6.1. Persiapan Kultur Bakteri Asam Laktat Fardiaz 1992
Kultur Lactobacillus sp. dibuka dari ampul dan disegarkan ke dalam 10 ml MRSB. MRSB dimasukkan ke dalam inkubator 37
o
C selama 48 jam. Setelah 48 jam, kultur Lactobacillus sp. kembali disegarkan dengan mengambil 1 ml dari
tabung MRSB lama ke tabung berisi MRSB baru. MRSB diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37
o
C.
3.6.2. Uji Viabilitas Bakteri Asam Laktat 3.6.2.1. Persiapan Jumlah Bakteri Asam Laktat
Sebanyak 1 ml kultur segar Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus plantarum
sa28k, dan Lactobacillus fermentum 2B4 dipindahkan ke dalam MRSB, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. 1 ml kultur dari masing- masing mikroba dipipet dan dimasukkan dalam larutan fisiologis NaCl 0.85
9 ml dan divorteks untuk pengenceran 10
-1
. Pengenceran dilakukan sampai 10
-6
dengan cara yang sama. Pemupukan dilakukan secara duplo pada pengenceran 10
-5
-10
-8
menggunakan MRSA dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37
o
C dalam posisi terbalik. Perhitungan koloni dilakukan setelah 48 jam berdasarkan metode BAM 2001 dalam satuan cfuml.
3.6.2.2. Penumbuhan Bakteri dalam Media Pati Resisten Jenie et al. 2006
Kultur awal berumur 24 jam diencerkan 10
-3
hingga jumlah mikroba awal adalah 10
-6
, lalu diambil 5 vv kemudian dimasukkan ke dalam tiga jenis media cair untuk pengujian aktivitas prebiotik. Media tersebut adalah m-MRSB
MRSB tanpa dekstrosa, air steril 50 mlsampel + 2.5 bv tepung pisang mengandung RS III, bebas lemak dan gula-gula sederhana serta MRSB-glu +
2.5 bv tepung pisang mengandung RS III, bebas lemak dan gula-gula sederhana. Ketiga media tersebut kemudian disterilkan terlebih dahulu.
Selanjutnya masing-masing media yang telah diinokulasikan tiga bakteri asam laktat tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Setelah inkubasi 24 jam, 1 ml larutan dipipet dan dimasukkan ke dalam
larutan pengencer NaCl 0.85 9 ml dan divorteks untuk pengenceran 10
-1
. Pengenceran dilakukan sampai 10
-8
dengan cara yang sama. Pemupukan dilakukan secara duplo pada pengenceran 10
-5
-10
-8
menggunakan MRSA dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37
o
C dalam posisi terbalik. Perhitungan koloni dilakukan setelah 48 jam berdasarkan metode BAM 2001
dalam satuan cfuml.
3.7. Analisis Statistik
Data hasil penelitian diolah secara statistik dengan menggunakan analisis sidik ragam ANOVA, yang dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf signifikasi
5 apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata antar sampel dengan menggunakan Software
SPSS 16.0 Production Facility.
3.8. Rancangan Penelitian