mengukur kadar kreatinin serum. Bahan terdiri atas dua reagen yaitu Reagen 1 dan Reagen 2 serta 1 serum standar.
f. Aquabidest. Aquabidest digunakan sebagai pencuci vitalab mikro dan juga sebagai blanko dalam pengukuran kadar kreatinin serum. Aquabidest ini
diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
g. Bahan pembuat preaparat ginjal. Untuk pembuatan preparat sel ginjal digunakan formalin 10, xilol, alkohol, lilin cetak, zat warna hematoksilin dan
eosin E. Merck, Darmstadt, Germany yang diperoleh dari Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner BPPV Regional IV Wates-Yogyakarta.
h. Natrium-Carboxymethyl Cellulosa CMC-Na. CMC-Na yang digunakan dalam bentuk serbuk, diperoleh dari Laboratorium Biofarmasetika
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
D. Alat dan Instrumen Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : 1. Seperangkat alat gelas berupa gelas kimia, Erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur,
corong kaca, pipet tetes, pipet gondok, batang pengaduk, tabung reaksi Pyrex, Iwaki Glass
2. Mortar dan stamper 3. Cawan porselen
4. Timbangan analitik 5. Oven Memmert
6. Sentrifuge
7. Vortex 8. Spuit per oral dan syringe 3 mL
9. Pipa kapiler 10. Corong Buchner
11. Vakum 12. Tabung eppendrof
13. Vitalab micro Microlab 200, Merck\
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi serbuk biji Persea americana Mill.
Determinasi serbuk biji Perseae americana Mill. dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri serbuk biji Perseae americana Mill. dengan serbuk biji
Persea americana Mill. yang telah dideterminasi dengan menggunakan buku acuan determinasi. Determinasi dilakukan secara makroskopis termasuk
organoleptis serbuk dan secara mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes Dwiatamaka, M.Si yang merupakan Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah biji Perseae americana Mill. yang telah diserbukkan dan diperoleh dari Padang, Sumatera Barat, Bulan Januari 2013.
3. Pembuatan serbuk
Biji Persea americana Mill. dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah bersih, biji kemudian dipotong-potong, disortir dan dikeringanginkan hingga biji
tidak tampak basah lagi, kemudian biji Persea americana Mill. dikeringan di
dalam oven pada suhu 50 C selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses
pengeringan. Setelah kering, biji diserbukkan dan diayak dengan ayakan nomor 40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji
Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar.
4. Pembuatan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.
Sebanyak 10 gram serbuk kering biji Persea americana Mill. diekstraksi dengan cara maserasi. Serbuk dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70 di
dalam Erlenmeyer bersumbat kaca. Ekstraksi dilakukan pada suhu kamar. Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1:10. Campuran serbuk dan
pelarut kemudian digojong selama 1 menit, didiamkan dalam ruangan gelap dan ditutup. Setiap harinya selama 5 hari berturut-turut pada jam yang sama dilakukan
penggojogan selama 1 menit. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Ekstrak kemudian diuapkan dengan
menggunakan rotary evaporator pada suhu 70 C hingga tidak ada lagi tetesan
pada rotary evaporator. Hasilnya kemudian dipindahkan ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya terlebih dahulu. Selanjutnya, dipekatkan
dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 C. dilakukan penimbangan
setiap harinya hingga bobot ekstrak tetap selisih bobot penimbangan dan bobot hasil penimbangan sebelumnya adalah sama. Kemudian ekstrak disimpan di
dalam desikator hingga saat akan digunakan.
5. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.
Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan cara susut pengeringan. Sebanyak 5,0 g serbuk biji Persea americana Mill. ditimbang dan
kemudian serbuk tersebut dimasukkan ke dalam alat moisture balance pada suhu 105
o
C selama 15 menit dan kemudian dilakukan perhitungan kadar air berdasarkan selisih bobot sebelum dimasukkan ke dalam alat sebelum
pemanasan dengan sesudah dimasukkan ke dalam alat moisture balance sesudah pemanasan selisih tersebut merupakan kadar air serbuk yang diteliti.
6. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa CMC-Na 1
Larutan CMC-Na 1 dibuat dengan cara menimbang 5,0 gram CMC-Na serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk
kemudian ditaburkan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan.
Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu
takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.
7. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.
dalam CMC-Na 1
Suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 7 bv. Pembuatan dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 3,5 g
ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. secara seksama. Ekstrak tersebut kemudian dilarutkan dengan menggunakan larutan CMC-Na 1 hingga seluruh
ekstrak terlarut dengan baik. Suspensi ekstrak dipindahkan ke dalam labu takar 50
mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1 hingga batas tanda, selanjutnya digojog hingga homogen.
8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida CCl
4
konsentrasi 50
Larutan CCl
4
dalam Olive Oil dibuat dengan cara melarutkan 25 mL CCl
4
dalam labu takar 50 mL kemudian ditambahkan dengan Olive Oil hingga tanda. Digojog hingga homogen. Pengambilan CCl
4
dilakukan dengan menggunakan pipet gondok 25 mL.
9. Uji pendahuluan
a. Penetapan waktu cuplikan darah. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan 4 kelompok perlakuan waktu.
Masing-masing kelompok menggunakan sejumlah 5 ekor tikus. Kelompok I diambil darah pada jam ke-0 atau sebelum dilakukan pemejanan karbon
tetraklorida CCl
4
, kelompok II diambil darah pada jam ke-24 setelah pemejanan CCl
4
2 mLkgBB
,
kelompok III diambil darah pada jam ke-48 setelah pemejanan CCl
4
2 mLkgBB dan kelompok IV diambil darah pada jam ke-72 setelah pemejanan
CCl
4
2 mLkgBB
.
Setelah pengambilan darah, darah diukur kadar kreatinin serum dan ditentukan waktu optimal pengukuran cuplikan darah
berdasarkan data kenaikan kreatinin serum. b. Penetapan lama pemberian ekstrak metanol biji Persea americana
Mill. Lama waktu pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill dilakukan selama 1, 4, 6 jam pada hari yang sama sebelum dipejankan senyawa
nefrotoksin karbon tetraklorida 2 mLkgBB dan diukur kadar kreatinin serum
pada waktu optimal pengukuran cuplikan darah, yaitu pada jam ke-48 setelah pemejanan karbon tetraklorida 2 mLkgBB.
10. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Sejumlah lima puluh dua ekor tikus dibagi secara acak ke dalam delapan kelompok perlakuan. Kelompok I kontrol nefrotoksin diberi larutan karbon
tetraklorida 2 mlKgBB secara intraperitonial. Kelompok II kontrol negatif diberi minyak zaitun Olive Oil dosis 2 mLkgBB. Kelompok III kontrol ekstrak
metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mgkgBB yang diberikan pada waktu 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mLkgBB. Kelompok IV
sampai dengan kelompok VIII berturut-turut diberi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mgkgBB pada selang waktu 1, 4 dan 6 jam sebelum
pemejanan karbon tetraklorida 2 mLkgBB. Pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill diakukan secara oral. Kemudian setelah 1, 4 dan 6 jam
pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dilakukan pemejanan karbon tetraklorida dosis 2 mLkgBB secara intraperitonial.
Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata pada waktu yang sama dengan waktu optimal pengukuran cuplikan darah, yaitu pada jam ke-
48. Cuplikan darah kemudian diambil serumnya untuk diukur aktivitas kreatinin serum.
11. Pembuatan serum
Darah tikus diambil melalui sinus orbitalis mata dan ditampung dalam eppendrof 1,5 ml melalui dinding tabung, didiamkan selama 15 menit. Dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit dan diambil
supernatannya serum, supernatan ditampung dalam eppendrof 1,5 mL. Serum yang belum diukur kemudian disimpan dalam lemari pembeku Freezer.
12. Penetapan kadar kreatinin serum
Alat yang digunakan untuk menganalisis kadar kreatinin serum adalah vitalab mikro. Kadar kreatinin serum diukur pada panjang gelombang 340 nm,
suhu 37 C dengan faktor koreksi -1745. Kadar kreatinin serum dinyatakan dalam
mgdL. Pengukuran kadar serum kreatinin dilakukan di Laboratorium Biokimia- Anatomi Manusia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Analisis dilakukan dengan cara sebagai berikut, sebanyak 50 μL serum dicampur
dengan reagen I sebanyak 1000 µL, divortex selama 5 detik. Didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan penambahan
reagen II sebanyak 250 μL, divortex 5 detik dan dibaca serapannya setelah didiamkan selama 2 menit.
13. Pembuatan formalin 10
Formalin yang diperoleh memiliki konsentrasi 37. Untuk memperoleh formalin dengan konsentrasi 10 maka dilakukan pengenceran formalin dengan
cara mengambil sebanyak 270 mL formalin 37, dimasukkan dalam labu takar 1 L dan ditambah dengan aquadest hingga batas tanda, digojog hingga homogen.
14. Pencuplikan organ ginjal tikus untuk pengamatan gambaran histologis
Tiga ekor hewan uji tikus jantan Wistar diambil secara acak untuk kemudian dikorbankan dengan menggunakan eter. Selanjutnya dilakukan nekropsi
hewan uji tikus untuk kemudian diambil organ ginjalnya. Organ ginjal dicuci dengan larutan saline 0.9 dan disimpan dalam wadah bertutup yang telah diisi
dengan formalin 10 untuk selanjutnya dibuat preparat di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
F. Tata Cara Analisis Hasil
Data yang diperoleh dalam penelitian diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas distribusi data dan Levene test untuk melihat
homogenitas variansi antar kelompok data sebagai syarat analisis parametrik. Data selanjutnya dianalisis dengan analisis variansi pola searah One Way ANOVA
dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan bermakna antar kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk
melihat pada kelompok manakah terdapat perbedaan yang bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna p0,05. Untuk kelompok kontrol negatif olive oil
2 mLkgBB pengolahan data dilakukan dengan menggunakan uji t-berpasangan. Perhitungan nefroprotektif terhadap nefrotoksin karbon tetraklorida diperoleh
dengan rumus :
Keterangan : KKS = Kadar kreatinin serum
36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penyiapan Bahan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu efektif pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. pada tikus jantan galur Wistar
terinduksi karbon tetraklorida dosis 2 mLkgBB dengan melihat kadar kreatinin serum dan gambaran histologis ginjal. Tujuan tersebut dapat tercapai dengan
serangkaian pengujian.
1. Hasil determinasi serbuk biji Persea americana Mill.
Determinasi serbuk biji Persea americana Mill. dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa serbuk biji yang digunakan adalah benar serbuk biji
Persea americana Mill. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi
dilakukan dengan cara mencocokkan kesamaan ciri serbuk biji yang digunakan dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang telah dideterminasi sebelumnya.
Hasil determinasi membuktikan bahwa benar serbuk biji yang digunakan dalam penelitian adalah serbuk biji Persea americana Mill. Hasil determinasi tertera
dalam lampiran 4.
2. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.
Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memastikan bahwa serbuk biji
Persea americana Mill. yang digunakan dalam penelitian memenuhi salah persyaratan serbuk yang baik, yaitu mengandung kadar air kurang dari 10
