III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan dari bulan Januari - Maret 2011.
3.2. Pemilihan Ikan Uji dan Bakteri Probiotik
Ikan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah benih ikan nila BEST dengan berat 15-20 g. Ikan nila dipelihara dalam akuarium berukuran 60x30x40 cm
3
3.3. Perlakuan dan Rancangan Penelitian
dengan kepadatan 10 ekorakuarium. Sebelum digunakan dalam perlakuan, benih ikan diadaptasikan terlebih dahulu selama 7 hari. Bakteri probiotik yang digunakan
dalam penelitian ini adalah bakteri NP5, yaitu dari genus Bacillus. Uji-uji yang telah dilakukan terhadap bakteri probiotik ini berupa uji ketahanan terhadap pH asam, uji
penempelan dan uji patogenisitas Putra 2010. Prebiotik yang digunakan adalah ekstraksi oligosakarida ubi jalar varietas sukuh.
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah Rancangan Acak Lengkap RAL yang terdiri dari 5 perlakuan dan 4 kali pengulangan. Adapun
perlakuannya adalah sebagai berikut : P0 + : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik, prebiotik, sinbiotik
dan diuji tantang dengan S. agalactiae P0 - : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik, prebiotik, sinbiotik dan
tanpa uji tantang dengan S. agalactiae P1 : Pemberian pakan dengan penambahan probiotik sebesar 1
1g100g pakan : Putra 2010 dan diuji tantang dengan S. agalactiae P2 : Pemberian pakan dengan penambahan prebiotik sebesar 2
2g100g pakan : Mahious et al.2006 dan diuji tantang dengan S. agalactiae P3 : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik
1 probiotik + 2 prebiotik dan diuji tantang dengan S. agalactiae
3.4. Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi 3 tahapan Gambar 1 yang akan dilaksanakan sebagai berikut :
Tahap 1. Uji in vitro bakteri kandidat Probiotik
Aktivitas antagonistik
Isolat bakteri NP5, diuji daya hambatnya terhadap S. agalactiae dengan metode Kirby-Bauer Lay 1994. Isolat S. agalactiae dan bakteri kandidat probiotik
NP5 yang telah berumur 24 jam diencerkan hingga memiliki tingkat kekeruhan yang sama dengan konsentrasi biakan suspensi sekitar 10
6
CFUml. Selanjutnya S. agalactiae disebar pada media Triptic Soy Agar TSA sebanyak 100 µl. Kertas
cakram Whatman antibiotic assay paper berdiameter 6 mm ditetesi suspensi bakteri kandidat probiotik sebanyak 10 µl, kemudian diletakkan diatas media TSA yang
telah diberi bakteri S. agalactiae. Sebagai kontrol digunakan larutan fisiologis. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 29
o
Peningkatan virulensi bakteri S. agalactiae
C selama 24 jam. Setelah itu diukur zona bening yang terbentuk menggunakan jangka sorong pada 4 posisi dari setiap kertas
cakram, kemudian dirata-ratakan.
Sebelum bakteri stok digunakan untuk uji tantang, dilakukan postulat koch sebanyak 2 kali untuk meningkatkan virulensi bakteri. Stok bakteri ditumbuhkan
pada media Brain Heart Infusion Broth BHIB 10 ml selama 24-48 jam. Ikan nila sehat sebanyak 10 ekor disuntik bakteri S. agalactiae dengan konsentrasi 0.1
mlekor. Sebagai kontrol ikan nila disuntik dengan larutan Phosphate Buffer Saline PBS dengan dosis yang sama. Ikan yang telah disuntik diamati selama 7 hari. Ikan
yang menunjukkan gejala klinis S. agalactiae seperti, warna tubuh menjadi gelap, garis-garis vertikal menjadi lebih gelap, mata menonjol, clear operculum operculum
mengalami lisis, berenang whirling dan juga kematian, diambil dan diisolasi. Bakteri diisolasi dari bagian organ target yaitu otak, mata dan ginjal ikan nila dalam
Brain Heart Infusion Agar BHIA dan media spesifik Kf Streptococcus untuk memperoleh isolat bakteri S. agalactiae yang virulen. Bakteri hasil postulat koch
inilah yang digunakan untuk pengujian selanjutnya.
Prosedur Penelitian
Gambar 1. Diagram alir pelaksanaan penelitian.
Peningkatan virulensi bakteri S. agalactiae
Probiotik NP5
Tahap 1. Pengujian secara In vitro
Pembuatan tepung ubi jalar
Ekstraksi Oligosakarida
Prebiotik
Tahap 2. Ekstraksi Oligosakarida
Tahap 3. Pengujian secara in vivo
Sinbiotik
Ikan nila dipelihara selama 14 hari dan diberi pakan 3x sehari dengan pemberian probiotik,
prebiotik dan sinbiotik dosis perlakuan Pengukuran parameter gambaran darah
pada hari ke-0, 7, 15 serta hari ke-7 dan hari ke-14 setelah uji tantang
dengan bakteri S.agalactiae Pengukuran jumlah koloni bakteri di usus
pada hari ke-15 dan histopatologi pada organ otak, mata, hati dan ginjal pada hari ke- 7
dan 14 setelah uji tantang Uji aktivitas antagonistik bakteri NP5
S.agalactiae secara in Vitro
Tahap 2 . Ekstraksi Oligosakarida
Pembuatan Tepung Ubi Jalar
Ubi jalar segar dibersihkan dan dikupas, kemudian diiris menggunakan pisau dengan ketebalan ±1 mm dan dikeringkan dalam oven suhu 55
C selama 5 jam atau hingga irisan ubi jalar dapat dipatahkan dengan tangan. Irisan ubi jalar kemudian digiling dengan
willey mill dan diayak 60 mesh. Tahapan dalam pembuatan tepung segar ubi jalar dapat dilihat pada diagram berikut :
Gambar 2. Tahapan pembuatan tepung ubi jalar. Ekstraksi dengan Etanol 70 Muchtadi 1989
Sebanyak 500 gram tepung ubi jalar dicampur air dengan perbandingan 1:1 wv dan dikukus pada suhu 100
C selama 30 menit. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 55
C selama 18 jam. Selanjutnya, digiling dan disaring dengan ayakan hingga tepung kukus ubi jalar dapat terkumpul. Pada proses ekstraksi, sebanyak 100 gram tepung kukus
ubi jalar disuspensikan ke dalam 1 L etanol 70 dan diaduk selama 15 jam menggunakan magnetic stirer pada suhu ruang. Setelah itu dilakukan penyaringan menggunakan kertas
saring mesh 40 dan residu dicuci dengan menggunakan etanol 70. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator vakum pada suhu 40
C. Hasil pemekatan di sentrifus Persiapan ubi jalar
Pengupasan dan pengirisan
Pengeringan pada 55 C, 5 jam
Penggilingan dengan willey mill
Pengayakan dengan 60 mesh
Tepung segar ubi jalar
pada 5000 rpm selama 10 menit untuk mengendapkan kotoran, sehingga ekstrak mudah disterilisasi dengan kertas saring.
Gambar 3. Ekstraksi Oligosakarida Ubi Jalar.
Total Padatan Terlarut TPT
Total padatan terlarut diukur berdasarkan metode Apriyantono 1989. Pengukuran TPT bertujuan untuk melihat kepekatan padatan terlarut prebiotik yang berguna pada analisa
oligosakarida pada tahap pengujian secara in vitro dan in vivo. Cawan porselin dikeringkan selama 2 jam dalam oven bersuhu 100
C, kemudian didinginkan dalam desikator hingga diperoleh berat tetap. Cawan tersebut kemudian ditimbang a gram. Sebanyak 1 ml
oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar ditempatkan dalam cawan porselen tersebut dan ditimbang b gram. Kemudian dimasukan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu
100 C. Setelah kering, cawan didinginkan dalam desikator selama 10 menit atau hingga
Tepung kukus ubi jalar
Ekstraksi dengan etanol 70
Pengadukan selama 15 jam Penyaringan
Pemekatan dengan evaporator vakum Sentrifus
Penyaringan Ekstrak oligosakarida
Tepung ubi jalar, dikukus pada suhu 100
C selama 30 menit
berat cawan stabil, kemudian cawan tersebut ditimbang c gram. Total padatan terlarut dihitung dari hasil perbandingan berat ekstrak setelah dikeringkan dengan berat ekstrak
sebelum dikeringkan. TPT=
a b
a c
− −
x 100
Keterangan : a = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida b = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida
c = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida dan dioven 24 jam.
Tahap 3. Pengujian secara In Vivo
Bakteri probiotik NP5 dengan konsentrasi 10
6
Pakan yang digunakan untuk pemeliharaan adalah pakan komersil dengan kandungan protein 38. Ikan nila diberi pakan 3 kali sehari yaitu pada pukul 07.30, 12.00
dan 16.30 secara at satiation. Pemberian probiotik, prebiotik dan sinbiotik dalam pakan dilakukan satu kali pada pagi hari selama 14 hari masa pemeliharaan Aly et al. 2008.
Setelah diberikan ke ikan, pakan perlakuan disimpan pada suhu 4 CFUml ditambahkan sebanyak 1
1g100g pakan Putra 2010. Sedangkan dosis prebiotik yang diberikan pada perlakuan P2 dan P3 adalah 2 atau 2 g100g pakan Mahious et al. 2006 dengan TPT 5 Marlis
2008. Probiotik, prebiotik dan sinbiotik dicampur atau ditambahkan ke dalam pakan dengan menambahkan kuning telur sebesar 2 sebagai perekat, lalu kemudian disemprotkan secara
merata menggunakan spuit Putra 2010.
o
C di dalam lemari pendingin sampai waktu pemberian pakan berikutnya. Pada hari ke-15 ikan nila diuji
tantang dengan injeksi bakteri S. agalactiae NK
1
0,1 mlekor pada konsentrasi 10
5
CFUml yang merupakan dosis LD
50
Taukhid 2009. Setelah injeksi S. agalactiae, ikan dipelihara selama 14 hari dan diberi pakan kontrol serta dilakukan pengamatan mengenai
kematian ikan, nafsu makan dan gejala klinis. Untuk menjaga kualitas air pada wadah pemeliharaan maka dilakukan penyiponan setiap hari sebanyak 10 dari total volume air
tiap akuarium.
3.5. Pengukuran Parameter