Pelaksanaan Penelitian METODE PENELITIAN

Prosedur Penelitian Gambar 1. Diagram alir pelaksanaan penelitian. Peningkatan virulensi bakteri S. agalactiae Probiotik NP5 Tahap 1. Pengujian secara In vitro Pembuatan tepung ubi jalar Ekstraksi Oligosakarida Prebiotik Tahap 2. Ekstraksi Oligosakarida Tahap 3. Pengujian secara in vivo Sinbiotik Ikan nila dipelihara selama 14 hari dan diberi pakan 3x sehari dengan pemberian probiotik, prebiotik dan sinbiotik dosis perlakuan Pengukuran parameter gambaran darah pada hari ke-0, 7, 15 serta hari ke-7 dan hari ke-14 setelah uji tantang dengan bakteri S.agalactiae Pengukuran jumlah koloni bakteri di usus pada hari ke-15 dan histopatologi pada organ otak, mata, hati dan ginjal pada hari ke- 7 dan 14 setelah uji tantang Uji aktivitas antagonistik bakteri NP5 S.agalactiae secara in Vitro Tahap 2 . Ekstraksi Oligosakarida Pembuatan Tepung Ubi Jalar Ubi jalar segar dibersihkan dan dikupas, kemudian diiris menggunakan pisau dengan ketebalan ±1 mm dan dikeringkan dalam oven suhu 55 C selama 5 jam atau hingga irisan ubi jalar dapat dipatahkan dengan tangan. Irisan ubi jalar kemudian digiling dengan willey mill dan diayak 60 mesh. Tahapan dalam pembuatan tepung segar ubi jalar dapat dilihat pada diagram berikut : Gambar 2. Tahapan pembuatan tepung ubi jalar. Ekstraksi dengan Etanol 70 Muchtadi 1989 Sebanyak 500 gram tepung ubi jalar dicampur air dengan perbandingan 1:1 wv dan dikukus pada suhu 100 C selama 30 menit. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 55 C selama 18 jam. Selanjutnya, digiling dan disaring dengan ayakan hingga tepung kukus ubi jalar dapat terkumpul. Pada proses ekstraksi, sebanyak 100 gram tepung kukus ubi jalar disuspensikan ke dalam 1 L etanol 70 dan diaduk selama 15 jam menggunakan magnetic stirer pada suhu ruang. Setelah itu dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring mesh 40 dan residu dicuci dengan menggunakan etanol 70. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator vakum pada suhu 40 C. Hasil pemekatan di sentrifus Persiapan ubi jalar Pengupasan dan pengirisan Pengeringan pada 55 C, 5 jam Penggilingan dengan willey mill Pengayakan dengan 60 mesh Tepung segar ubi jalar pada 5000 rpm selama 10 menit untuk mengendapkan kotoran, sehingga ekstrak mudah disterilisasi dengan kertas saring. Gambar 3. Ekstraksi Oligosakarida Ubi Jalar. Total Padatan Terlarut TPT Total padatan terlarut diukur berdasarkan metode Apriyantono 1989. Pengukuran TPT bertujuan untuk melihat kepekatan padatan terlarut prebiotik yang berguna pada analisa oligosakarida pada tahap pengujian secara in vitro dan in vivo. Cawan porselin dikeringkan selama 2 jam dalam oven bersuhu 100 C, kemudian didinginkan dalam desikator hingga diperoleh berat tetap. Cawan tersebut kemudian ditimbang a gram. Sebanyak 1 ml oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar ditempatkan dalam cawan porselen tersebut dan ditimbang b gram. Kemudian dimasukan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 100 C. Setelah kering, cawan didinginkan dalam desikator selama 10 menit atau hingga Tepung kukus ubi jalar Ekstraksi dengan etanol 70 Pengadukan selama 15 jam Penyaringan Pemekatan dengan evaporator vakum Sentrifus Penyaringan Ekstrak oligosakarida Tepung ubi jalar, dikukus pada suhu 100 C selama 30 menit berat cawan stabil, kemudian cawan tersebut ditimbang c gram. Total padatan terlarut dihitung dari hasil perbandingan berat ekstrak setelah dikeringkan dengan berat ekstrak sebelum dikeringkan. TPT= a b a c − − x 100 Keterangan : a = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida b = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida c = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida dan dioven 24 jam. Tahap 3. Pengujian secara In Vivo Bakteri probiotik NP5 dengan konsentrasi 10 6 Pakan yang digunakan untuk pemeliharaan adalah pakan komersil dengan kandungan protein 38. Ikan nila diberi pakan 3 kali sehari yaitu pada pukul 07.30, 12.00 dan 16.30 secara at satiation. Pemberian probiotik, prebiotik dan sinbiotik dalam pakan dilakukan satu kali pada pagi hari selama 14 hari masa pemeliharaan Aly et al. 2008. Setelah diberikan ke ikan, pakan perlakuan disimpan pada suhu 4 CFUml ditambahkan sebanyak 1 1g100g pakan Putra 2010. Sedangkan dosis prebiotik yang diberikan pada perlakuan P2 dan P3 adalah 2 atau 2 g100g pakan Mahious et al. 2006 dengan TPT 5 Marlis 2008. Probiotik, prebiotik dan sinbiotik dicampur atau ditambahkan ke dalam pakan dengan menambahkan kuning telur sebesar 2 sebagai perekat, lalu kemudian disemprotkan secara merata menggunakan spuit Putra 2010. o C di dalam lemari pendingin sampai waktu pemberian pakan berikutnya. Pada hari ke-15 ikan nila diuji tantang dengan injeksi bakteri S. agalactiae NK 1 0,1 mlekor pada konsentrasi 10 5 CFUml yang merupakan dosis LD 50 Taukhid 2009. Setelah injeksi S. agalactiae, ikan dipelihara selama 14 hari dan diberi pakan kontrol serta dilakukan pengamatan mengenai kematian ikan, nafsu makan dan gejala klinis. Untuk menjaga kualitas air pada wadah pemeliharaan maka dilakukan penyiponan setiap hari sebanyak 10 dari total volume air tiap akuarium.

3.5. Pengukuran Parameter

Pengukuran parameter dalam penelitian meliputi gambaran darah, histopatologi, jumlah bakteri pada otak, mata dan ginjal, jumlah bakteri di usus, tingkat kelangsungan hidup dan pertumbuhan berat mutlak.

3.5.1 Gambaran Darah

Pengukuran parameter gambaran darah dilakukan sebanyak 5 kali yaitu pada hari ke- 0, 7, 14, kemudian pada hari ke-7 dan hari ke-14 setelah uji tantang. Adapun parameter gambaran darah yang diukur adalah sebagai berikut :

a.Total eritrosit

Jumlah eritrosit dihitung menurut Blaxhall dan Daisley 1973. Perhitungan eritrosit dengan cara : sampel darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 1, kemudian ditambahkan larutan Hayem’s sampai skala 101, digoyang atau diayunkan membentuk angka delapan selama 3-5 menit agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, berikutnya diteteskan ke dalam hemasitometer dan ditutup dengan kaca penutup, diamati dibawah mikroskop. Perhitungan dilakukan pada kotak kecil hemasitometer, Σ eritrosit = Σ sel eritrosit terhitung x pengencer volume

b. Kadar hemoglobin Hb

Pengukuran kadar hemoglobin dilakukan dengan metode Sahli dengan sahlinometer Wedemeyer dan Yasutake 1977. Kadar Hb diukur dengan cara mengkonversikan darah ke dalam bentuk asam hematin setelah darah ditambah dengan HCl 0,1 N. Prosedur perhitungan dilakukan dengan cara : darah dihisap dengan pipet Sahli sampai skala 20 mm 3 atau skala 0,2 ml, lalu ujung pipet dibersihkan dengan kertas tissue. Setelah itu darah dalam pipet dipindahkan dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0,1 N sampai skala 10 merah, aduk dan biarkan selama 3 sampai 5 menit. Tambahkan akuades sampai warna darah dan HCl tersebut seperti warna larutan standar yang ada dalam Hb meter tersebut. Kemudian skala dibaca yaitu dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung Sahli yang dilihat pada skala jalur gr kuning yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah.

c. Kadar hematokrit He

Kadar hematokrit He diukur menurut Anderson dan Siwicki 1993. Kadar He ditentukan dengan cara: sampel darah dimasukkan dalam tabung mikrohematokrit sampai kira-kira 34 bagian tabung, kemudian ujungnya disumbat dengan crytoseal sedalam 1 mm. Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Setelah itu dilakukan pengukuran panjang darah yang mengendap a serta panjang total volume darah yang terdapat didalam tabung b. Kadar He dinyatakan sebagai volume padatan sel darah dan dihitung dengan cara = ab x 100.

d. Total leukosit

Jumlah leukosit dihitung menurut Blaxhall dan Daisley 1973 yaitu : sampel darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk berwarna putih berskala sampai 0,5 ml. Lalu ditambahkan larutan turk’s sampai skala 11. Selanjutnya pipet digoyang membentuk angka delapan selama 5 menit agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, tetesan berikutnya dimasukkan kedalam hemasitometer ditutup dengan kaca penutup, diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dila kukan pada kotak kecil hemasitometer, Σ leukosit = Σ sel leukosit terhitung x volume pengencer.

e. Diferensial leukosit

Diferensial leukosit ditentukan mengikuti Amlacher 1970. Perhitungan dilakukan dengan mengamati preparat ulas darah. Darah diteteskan diatas gelas objek steril yang sudah direndam dengan metanol, kemudian ujung gelas objek kedua ditempatkan di atas gelas objek yang telah ditetesi darah hingga membentuk sudut 30 o

f. Indeks fagositik

C. Gelas objek kedua digeser kearah belakang menyentuh tetesan darah hingga menyebar. Kemudian gelas objek kedua digeser kerarah berlawanan hingga terbentuk lapisan tipis darah, dibiarkan hingga kering. Preparat difiksasi dengan metanol absolute selama 5 menit kemudian diangkat dan dibiarkan kering udara. Pewarnaan preparat dilakukan selama 10 menit dalam larutan giemsa, lalu diangkat dan dibilas dengan air mengalir dan dibiarkan kering udara. Preparat ulas diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali. Kemudian dihitung jenis- jenis leukosit dan dihitung persentasenya.