Suhu oven : awal 125
o
C diam 5 menit akhir 225
o
C diam 7 menit rata-rata 3
o
Cmenit Ratio
: 1 : 80 Volume injeksi
: 1 µ L Linier velocity
: 20 cmsec Nama standar
: FAME Mix 37 components produksi Supelco
3.4.8 Analisis kolesterol AOAC 994.10
Analisis kolesterol menggunakan metode kromatografi gas. Analisis ini terdiri dari beberapa tahap yaitu penyabunan, ekstraksi, dan tahap derivatisasi.
Analisis kolesterol dimulai dari tahap penyabunan yaitu dengan cara menimbang 2-3 g sampel kemudian dimasukkan ke erlenmeyer dan ditambah 40 mL etanol
95 dan 8 mL KOH 50 , kemudian sampel distirrer dan direfluks dengan suhu 70 °C selama kurang lebih 10 detik. Sampel selanjutnya ditambahkan 60 mL
etanol 95 melalui atas kondensor dan didiamkan sampai suhu ruangan. Tahap ekstraksi yaitu dimulai dengan hasil dari penyabunan ditambah 100
mL toluene, distirrer selama 30-60 detik. Hasil saringan ditambah 110 mL KOH 1 M lalu dikocok, fase air dibuang dan ditambah 40 mL KOH 0,5M dikocok lagi,
fase air dibuang dan diulangi pencucian dengan air 3 kali. Lapisan toluene disaring melalui glass wool dan dimasukkan ke erlenmeyer yang berisi 20 g
Na
2
SO
4
anhidrat kemudian dikocok dan didiamkan selama 15 menit. Ekstrak dipipet sebanyak 25 mL kemudian dilarutkan residu dalam 3 mL DMF.
Tahap derivatisasi yaitu dimulai dengan memipet sebanyak 1 mL larutan standar dan sampel, masing-masing ditambahkan 0,2 mL HMDS+0,1 mL TMCS
dikocok selama 30 menit, didiamkan selama 15 menit sampai tidak keruh kemudian ditambah 1 mL
5α-cholestane internal standar + 10 mL H
2
O dikocok selama 30 detik. Lapisan heptanes lapisan atas diambil kemudian diinjeksikan
ke GC. Perhitungan banyaknya kolesterol dalam sampel sebagai berikut:
mg kolesterol100 g sampel spl I spl
std I std std toluene
ekstrak M g sampel
Kondisi kromatografi pada saat analisis kolesterol : Fase diam kolom : kolom 5 phenyl-methyl silicone
Gas pembawa : hidrogen-helium
Detektor : FID Flame Ionizazion Detector
Suhu injektor : 250 °C
Suhu detektor : 300 °C
Suhu kolom : 190 °C, ditahan 2 menit, dinaikkan 20 °Cmenit sampai
230 °C, ditahan 3 menit dinaikkan 40 °Cmenit sampai 25 °C, ditahan 25 menit.
Nama standar : Cholesterol produksi Sigma
3.4.9 Analisis fitokimia Harborne 1987
Analisis fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar keong mata lembu. Analisis fitokimia yang dilakukan
terdiri dari alkaloid, steroidtriterpenoid, saponin, flavonoid, fenol hidrokuinon, molisch, benedict, biuret, ninhidrin.
1 Alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi dragendorf, meyer, dan wagner.
Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi meyer terbentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi wagner membentuk endapan coklat dan dengan
pereaksi dragendorf membentuk endapan merah sampai jingga. Pereaksi meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl
2
dengan 0,5 g kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 mL dalam labu takar.
Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi wagner dibuat dengan cara 10 mL akuades dipipet kemudian ditambah 2,5 g iodin dan 2 g kalium iodida, selanjutnya
dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 mL dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat.
Pereaksi dragendorf dibuat dengan cara 0,8 g bismut subnitrat ditambah dengan 10 mL asam asetat dan 40 mL air. Larutan ini dicampur dengan larutan
yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam 20 mL air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 mL asam
asetat glasial dan 100 mL air. Pereaksi berwarna jingga.
2 Steroidtriterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 mL kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes
ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama
kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
3 Saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan
sampel mengandung saponin.
4 Flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 mL amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume sama dan
4 mL alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif menunjukkan bahwa sampel mengandung flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau
jingga pada lapisan amil alkohol.
5 Fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 mL etanol 70 . Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambah 2 tetes larutan FeCl3 5 .
Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru.
6 Molisch
Sebanyak 1 mL larutan sampel ditambah 2 tetes pereaksi molisch dan 1 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif menunjukkan sampel
mengandung karbohidrat dan ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
7 Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 mL pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif
menunjukkan sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.
8 Biuret
Larutan sampel sebanyak 1 mL ditambah pereaksi biuret sebanyak 4 mL. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif menunjukkan sampel
mengandung senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu.
9 Ninhidrin
Larutan sampel sebanyak 2 mL ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1 . Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji
positif menunjukkan sampel mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru.
3.4.10 Analisis aktivitas antioksidan Molyneux 2004
Ekstrak keong mata lembu dari hasil ekstraksi bertingkat dan hasil pemurnian dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan
800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol p.a. dengan
konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM.
Masing-masing sampel uji dan pembanding diambil 4,50 mL dan direaksikan dengan 500 μL larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah
diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS
Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 516 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat
dengan mereaksikan 4,50 mL pelarut metanol dengan 500 μL larutan DPPH
1 mM dalam tabung reaksi. Nilai persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus:
inhibisi bsorbansi blanko bsorbansi sampel
bsorbansi blanko
Nilai konsentrasi contoh ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan
regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC
50
inhibitor concentration 50 dari
