3.4.5 Analisis asam amino AOAC 975.44
Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid Chromatography HPLC. Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas
dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Analisis asam
amino menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap yaitu 1 tahap pembuatan hidrolisat protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; dan 4 tahap
injeksi serta analisis asam amino. 1
Tahap pembuatan hidrolisat protein Tahap preparasi sampel adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya
sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 0,2 g dan dihancurkan. Hancuran sampel ditambah dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 mL, kemudian dipanaskan
dalam oven pada suhu 100
o
C selama 24 jam. Tujuannya untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu kromatogram yang
dihasilkan, juga untuk mempercepat reaksi hidrolisis. Hidrolisat protein yang telah dipanaskan kemudian disaring dengan milipore berukuran 45 µ.
2 Tahap pengeringan
Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trimetilamim dengan perbandingan 2:2:1. Pengeringan dilakukan dengan gas
nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi. 3
Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi
sebanyak 30 μL ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat,
dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel, selanjutnya
dilakukan pegenceran dengan cara menambahkan 10 mL asetonitil 60 atau buffer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring
kembali menggunakan milipore berukuran 0,45 µ. 4
Injeksi ke HPLC Hasil sarin
gan diambil sebanyak 20 μL untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan
kromatogram sampel dengan standar, pembuatan kromatogram standar menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.
Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:
Konsentrasi asam amino Luas areal sampel
Luas areal standar obot sampel
Keterangan : C
konsentrasi standar asam amino 5 μg FP
= faktor pengenceran 10 mL BM
= bobot molekul dari masing-masing asam amino gmol Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino:
Merek : waters coorporation, USA
Kolom : accQtag column 3,9 x 150 mm
Temperatur : 37
o
C Fase gerak
: acetonitril 60 - AccqTag Eluent A, sistem gradien komposisi
Laju alir : 1,0 mL per menit
Detektor : fluorescense, Eksitasi = 250 nm, emisi = 395 nm
Volume penyuntikan : 5 uL Nama standar
: Amino acid standar produksi Thermo Scientific
3.4.6 Analisis taurin AOAC 997.05
Kandungan taurin dapat dianalisis menggunakan alat HPLC dengan beberapa tahapan sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 1 g dan
dimasukkan ke labu ukur 100 mL, kemudian ditambah 80 mL air suling dan 1 mL pereaksi Carrez 1 lalu kocok hingga homogen. Sampel yang telah homogen
kemudian ditambah 1 mL pereaksi Carrez 2, kemudian kocok hingga homogen. Sampel yang telah ditambah pereaksi Carrez 1 dan 2 kemudian diencerkan dengan
cara menambahkan air suling sampai tanda tera labu ukur dan kocok hingga homogen. Sampel disaring menggunakan kertas saring Whatman. Filtrat
ditampung dengan erlenmeyer dan disimpan ditempat gelap. Tahap selanjutnya adalah tahap derivatisasi yaitu dengan mengambil 10 mL
ekstrak sampel dimasukkan ke labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan 1 mL
buffer natrium karbonat dan 1 mL larutan dansil klorida. Sampel didiamkan selama 2 jam lalu dikocok dan ditambahkan 0,5 mL larutan metilamin
hidroklorida dan air suling sampai tanda tera 10 mL, kemudian dikocok kembali hingga homogen. Hasil derivatisasi diambil sebanyak 20 μL kemudian
diinjeksikan ke HPLC untuk mengetahui kandungan taurin pada sampel. Kandungan taurin dalam100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus :
Keterangan : Csp
= konsentrasi contoh, dinyatakan dalam mg100 g Asp
= luas area contoh Astd = luas area standar
Cstd = konsentrasi larutan standar dalam mgL
Vsp = volume pelarutan sampel, dinyatakan dalam mL
Wsp = bobot contoh, dinyatakan dalam g
10 = konversi dalam 100 g sampel
Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis taurin: Merek
: waters coorporation, USA Kolom
: oktadesilsilana C18 Laju alir
: 1 mLmenit Fase gerak
: Bufer Natrium Asetat 0,01 M pH 4,2 : Asetonitril 84:16 Detektor
: Flourescence : eksitasi 330 nm, emisi 530 nm Nama standar : Amino acid standar produksi Thermo Scientific
3.4.7 Analisis asam lemak AOAC 963.22
Asam lemak merupakan komponen lemak. Kandungan asam lemak dapat ditentukan dengan metode gas kromatografi didasarkan pada partisi komponen-
komponen dari suatu cairan di antara fasa gerak berupa gas dan fasa diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan
pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan sehingga suhu operasi biasanya lebih tinggi
dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh yang sulit menguap.
Dalam hal analisis asam lemak, maka mula-mula lemakminyak dihidrolisis menjadi asam lemak, kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang
bersifat lebih mudah menguap. Dalam metode ini, transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam lemak FAME. Metil ester
asam lemak FAME ini dianalisis dengan alat kromatografi gas. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan membandingkan waktu retensinya dengan standar
pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak
komponen yang dipertimbangkan. Penentuan kandungan komponen dalam contoh dapat dilakukan dengan
teknik standar eksternal atau internal standar. Luas puncak dari masing-masing komponen adalah berbanding lurus dengan jumlah komponen tersebut dalam
contoh, untuk meminimalkan kesalahan akibat volume injeksi, preparasi sampel, pengenceran dan sebagainya, lebih baik digunakan teknik standar internal,
disamping itu koreksi terhadap respon detektor dan interaksi antar komponen dalam matrik contoh selama melewati kolom juga harus dilakukan.
a Preparasi contoh hidrolisis dan esterifikasi
Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg atau minyak dalam tabung tertutup teflon, ditambah 1 mL NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan
dalam penangas air selama 20 menit. Sebanyak 2 mL BF
3
16 dan 5 mgmL standar internal ditambahkan. Larutan tersebut lalu dipanaskan lagi selama 20
menit, Sampel yang telah dingin ditambah 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL n-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan n-heksana dipindahkan dengan bantuan pipet
tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 g Na
2
SO
4
anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fase cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke kromatografi gas.
b Analisis komponen asam lemak sebagai FAME
Pelarut sebanyak 1 µ L diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalam
kurang dari 1 menit. Sampel diinjeksikan 5 µL campuran standar FAME setelah pena kembali ke nol baseline, jika semua puncak sudah keluar, sebanyak 5 µL
Kategori