Pengambilan dan preparasi sampel

n-heksana, kloroform, dikhlorometan, etil asetat, etanol dan metanol. Pencarian eluen terbaik dimulai dengan menggunakan eluen tunggal sampai dengan eluen campuran atau perbandingan. Sebanyak 10 mL eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup, kemudian dibiarkan beberapa menit sampai larutan menjadi jenuh. Ekstrak kasar yang terpilih sebanyak 0,02 g dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya, kemudian ditotolkan pada garis bagian bawah yang ditandai pada plat kromatografi lapis tipis sepanjang 10 cm menggunakan pipa kapiler dan dikeringkan beberapa menit plat dimasukkan ke dalam chamber dengan posisi agak tegak, sampel yang ditotolkan berada pada bagian bawah dan diusahakan tidak terendam oleh eluen. Chamber ditutup dan ditunggu sampai sampel terbawa eluen pada batas atas. Plat kromatografi lapis tipis dikeluarkan dan dikeringkan. Selanjutnya plat dilihat hasilnya dengan menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm. Setelah ditemukan eluen terbaik, dilanjutkan dengan kromatografi preparatif. Prosedur yang dilakukan hampir sama dengan KLT namun dengan ukuran yang lebih besar. Pembuatan preparat dengan menggunakan silika gel 60 F 254 yang dipasang pada lempeng kaca dengan ukuran 20x20 cm. Eluen terbaik yang diperoleh disiapkan sebanyak 20 mL dan dimasukkan ke dalam chamber. Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber, setelah dilihat hasilnya dengan sinar UV 254 nm, kemudian setiap fraksi atau masing-masing Rf Retardation factor yang dihasilkan dikerok dan dikumpulkan. Hasil pengerokan dilarutkan dengan pelarut yang sama dengan sampel terpilih. Hasil dari masing-masing fraksi diuji aktivitas antioksidannya untuk memilih fraksi terbaik. 3.3.4 Identifikasi senyawa aktif Fraksi terpilih dengan aktivitas antioksidan terbaik dilanjutkan dengan melihat komponen senyawa yang terdapat didalamnya menggunakan Liquid chromatography mass spectrometry LC-MS Agilent Technologies. Teknik ini dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul. Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif ini yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi dan dicocokkan dengan senyawa yang ada pada library LC-MS dengan kemiripan 90 . Tabel 1 Kondisi dan spesifikasi operasi alat LC-MS Kondisi LC Spesifikasi dan program pengaturan Alat UPLC- qToF-MSMS System Waters HPLC UPLC Acquity SDS Waters Column Acquity UPLC BEH C18 1.7um, 2.1x50 mm Flow rate 0.3 mLmin Injection 5 uL Suhu 40 °C Eluent fase gerak A: H2O+0.1 formic acid, B: Acetonitrile + 0.1 formic acid Gradient method Time min A B 95 5 1 95 5 6 100 6,7 100 7 95 5 9 95 5 MS XEVO – G 2 QTOF waters, ESI positif Capillary voltage 3 kV Sample cone voltage 38 V Desolvation T 300 °C Source T 110 °C Desolvation gas 500 Lh Cone gas 16 Lh Cara kerja LC adalah sama dengan HPLC, mula-mula eluen diambil melalui pompa. Eluen ini kemudian dimasukkan ke dalam katup injeksi berputar. Sampel dimasukkan ke dalam katup injeksi dengan bantuan mikrosiring yang kemudian bersama-sama dengan eluen masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detektor kemudian direkam. Tekanan eluen diatur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk eluen pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah. Analit bersama dengan eluen dari syringe pump atau LC dimasukkan ke dalam cappilary. Analit dan eluen disemprotkan spray melalui taylor cone, sehingga terbentuk tetesan-tetesan droplet. Droplet yang mengalami pemecahan coulombic explosion tersebut akan masuk ke dalam cone dimana sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas nitrogen. Gas ini berfungsi agar analit yang terjadi stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen. Droplet yang masuk ke dalam cappilary transfer akan dianalisis melalui mass spectrofotometer.

3.4 Analisis

Analisis yang dilakukan pada tahap ini meliputi analisis rendemen, analisis proksimat kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan karbohidrat, vitamin A, B 12 , D, dan E, analisis asam amino, taurin, asam lemak, dan kolesterol AOAC 2005, analisis mineral SNI 01-2891-1992, fitokimia Harborne 1987, analisis antioksidan Molyneux 2004, dan toksisitas Carballo 2002.

3.4.1 Analisis rendemen daging keong mata lembu Hustiany 2005

Rendemen adalah persentase bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan. Daging keong mata lembu utuh ditimbang beratnya baik sebelum maupun sesudah diambil cangkang dan jeroannya kemudian dikeringkan menggunakan oven. Daging keong mata lembu yang telah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelah dikeringkan. Rendemen merupakan persentase perbandingan antara bagian yang digunakan dengan berat utuh daging keong mata lembu segar. endemen berat bagian yang digunakan gram berat keong mata lembu gram

3.4.2 Analisis proksimat AOAC 2005

Daging keong mata lembu segar dan kering diuji komposisi kimianya yang terdiri atas kadar air, abu, protein, lemak, karbohidrat dan serat kasar. 1 Analisis kadar air AOAC 950.46 Analisis kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven. Prosedur analisis kadar air sebagai berikut: cawan yang akan digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105 o C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang A. Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan B kemudian dioven pada suhu 100-105 o C selama 6 jam lalu didinginkan hingga mencapai suhu ruang dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang C. Tahap ini diulangi hingga