Pengambilan dan preparasi sampel
n-heksana, kloroform, dikhlorometan, etil asetat, etanol dan metanol. Pencarian eluen terbaik dimulai dengan menggunakan eluen tunggal sampai dengan eluen
campuran atau perbandingan. Sebanyak 10 mL eluen dimasukkan ke dalam
chamber dan ditutup, kemudian dibiarkan beberapa menit sampai larutan menjadi jenuh. Ekstrak kasar yang terpilih sebanyak 0,02 g dilarutkan dalam 0,5 mL
pelarutnya, kemudian ditotolkan pada garis bagian bawah yang ditandai pada plat kromatografi lapis tipis sepanjang 10 cm menggunakan pipa kapiler dan
dikeringkan beberapa menit plat dimasukkan ke dalam chamber dengan posisi agak tegak, sampel yang ditotolkan berada pada bagian bawah dan diusahakan
tidak terendam oleh eluen. Chamber ditutup dan ditunggu sampai sampel terbawa eluen pada batas atas. Plat kromatografi lapis tipis dikeluarkan dan dikeringkan.
Selanjutnya plat dilihat hasilnya dengan menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm.
Setelah ditemukan eluen terbaik, dilanjutkan dengan kromatografi preparatif. Prosedur yang dilakukan hampir sama dengan KLT namun dengan
ukuran yang lebih besar. Pembuatan preparat dengan menggunakan silika gel 60 F
254
yang dipasang pada lempeng kaca dengan ukuran 20x20 cm. Eluen terbaik yang diperoleh disiapkan sebanyak 20 mL dan dimasukkan ke dalam chamber.
Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber, setelah dilihat hasilnya dengan sinar UV 254 nm, kemudian setiap fraksi atau
masing-masing Rf Retardation factor yang dihasilkan dikerok dan dikumpulkan. Hasil pengerokan dilarutkan dengan pelarut yang sama dengan sampel terpilih.
Hasil dari masing-masing fraksi diuji aktivitas antioksidannya untuk memilih fraksi terbaik.
3.3.4 Identifikasi senyawa aktif Fraksi terpilih dengan aktivitas antioksidan terbaik dilanjutkan dengan
melihat komponen senyawa yang terdapat didalamnya menggunakan Liquid chromatography mass spectrometry LC-MS Agilent Technologies. Teknik ini
dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul. Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif ini yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi
dan dicocokkan dengan senyawa yang ada pada library LC-MS dengan kemiripan 90 .
Tabel 1 Kondisi dan spesifikasi operasi alat LC-MS Kondisi LC
Spesifikasi dan program pengaturan Alat
UPLC- qToF-MSMS System Waters HPLC
UPLC Acquity SDS Waters Column
Acquity UPLC BEH C18 1.7um, 2.1x50 mm Flow rate
0.3 mLmin Injection
5 uL Suhu
40 °C Eluent fase gerak
A: H2O+0.1 formic acid, B: Acetonitrile + 0.1 formic acid
Gradient method Time min
A B
95 5
1 95
5 6
100 6,7
100 7
95 5
9 95
5 MS
XEVO – G
2
QTOF waters, ESI positif Capillary voltage
3 kV Sample cone voltage
38 V Desolvation T
300 °C Source T
110 °C Desolvation gas
500 Lh Cone gas
16 Lh Cara kerja LC adalah sama dengan HPLC, mula-mula eluen diambil melalui
pompa. Eluen ini kemudian dimasukkan ke dalam katup injeksi berputar. Sampel dimasukkan ke dalam katup injeksi dengan bantuan mikrosiring yang kemudian
bersama-sama dengan eluen masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detektor kemudian direkam. Tekanan eluen diatur dengan pengatur dan
pengukur tekanan. Pompa pemasuk eluen pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah. Analit bersama dengan eluen dari
syringe pump atau LC dimasukkan ke dalam cappilary. Analit dan eluen disemprotkan spray melalui taylor cone, sehingga terbentuk tetesan-tetesan
droplet. Droplet yang mengalami pemecahan coulombic explosion tersebut akan masuk ke dalam cone dimana sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas nitrogen.
Gas ini berfungsi agar analit yang terjadi stabil dalam bentuknya dan tidak
terganggu oleh pengaruh gas oksigen. Droplet yang masuk ke dalam cappilary transfer akan dianalisis melalui mass spectrofotometer.