Liebermann-Burchard dan dipanaskan di oven pada suhu 105°C selama 15 menit lalu diamati warna yang terbentuk.
3.11 Fraksinasi Fraksi n-heksana dengan KCV Kromatografi Cair Vakum.
Fraksi n-heksana difraksinasi dengan KCV menggunakan fase gerak landaian n-heksana - etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20,
70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100 dan metanol 100 dan fase diam silika gel 60H.
Cara kerja: Sebagai kolom digunakan corong Buchner kaca masir, kedalam corong
Buchner kaca masir dimasukkan kertas saring sebagai alas bawah, lalu dimasukkan silika gel 60 H yang dikemas dalam keadaan kering, lalu diatasnya
ditutup kembali dengan kertas saring. Alat vakum dihidupkan untuk memperoleh kerapatan yang maksimum. Kemudian cuplikan yang telah dicampur dengan
silika gel 60 H diletakkan pada bagian atas kolom yang disebar secara merata, lalu di atasnya diletakkan kertas saring. Alat vakum dihidupkan kembali. Sampel
dielusi dengan pelarut mulai dari kepolaran rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dan kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi
Hostettmann, et al., 1995.
3.12 Analisis KLT Hasil KCV
Hasil fraksinasi yang telah dipekatkan tersebut di KLT menggunakan fase diam plat pra lapis silika gel GF
254
3.13 Isolasi Senyawa Hasil Fraksinasi secara Kromatografi Kolom
, pengembang n-heksana - etilasetat terpilih dengan penampak bercak Liebermann-Burchard. Diperoleh 12 fraksi dan pola
kromatogram yang sama digabungkan.
Universitas Sumatera Utara
Terhadap fraksi aktif dari hasil pemisahan dengan KCV dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom. Fase diam silika gel, mesh 70-230 ASTM
dengan ukuran partikel 0,063-0,200 µm dan fase gerak n-heksana: etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60,
30:70, 20:80, 10:90, 0:100 dan metanol. Cara kerja: Seperangkat alat kromatografi kolom dipasang, kemudian ke dalam
dasar kolom dimasukkan kapas yang yang telah dicuci dengan n-heksana. Silika gel disuspensikan dengan n-heksana, diaduk sampai homogen dan dimasukkan ke
dalam kolom yang telah diisi dengan n-heksana sambil dinding kolom diketuk- ketuk jika perlu untuk menghilangkan gelembung udara dan dialiri dengan n-
heksana sampai memadat, kemudian n-heksana diturunkan sampai 2 cm di atas permukaan kolom. Kolom yang sudah dikemas ditutup dan dibiarkan selama 24
jam. Fraksi yang aktif dicampur dengan sedikit fase diam, lalu dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan dan merata ketebalannya. Kran dibuka
perlahan-lahan sambil fase gerak ditambah sedikit demi sedikit dan dijaga agar ada genangan fase gerak di atas sampel. Kecepatan tetesan yang keluar sama
dengan tetesan pelarut dari reservoar. Hasil elusi masing-masing ditampung 5 mL dalam vial yang telah diberi nomor.
3.14 Analisis Eluat hasil fraksinasi kolom dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT.
Selanjutnya kandungan kimia eluat yang keluar dipantau dengan KLT dengan penampak bercak Liebermann-Burchard. Hasil KLT dengan pola
kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi.
Universitas Sumatera Utara
3.15 Uji kemurnian Isolat
