3.5.2 Pembuatan media kultur lengkap MK
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Penisilin-Streptomisin 2
Fungizone Amfoterisin B 0,5
RPMI ad 100 mL
Cara Pembuatan: Semua bahan di atas dicampur dan dilakukan di dalam ruangan dengan LAF
Laminar Air Flow, botol MK diberi label nama media, tanggal pembuatan, expire date
, dan nama pembuat lalu disimpan pada suhu 2 - 8
o
3.6 Penumbuhan Sel MCF-7
C.
3.6.1 Penumbuhan sel
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 mL media RPMI pada tabung konikel, diambil ampul dari freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, diambil suspensi sel dalam ampul,
dimasukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, dibuang supernatan dan tambahkan 4
mL MK RPMI dan resuspensi hingga homogen. Ditransfer masing-masing 2 mL ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 mL MK ke dalam masing-masing flask
kultur dan dihomogenkan. Dimati kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak
menggerombol pada bagian tertentu. Diberi identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2
.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2 Subkultur sel
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, dilakukan pengerjaan pada LAF. Dilakukan proses panen sel dengan cara mengambil 500
µL panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 mL MK, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO
2
3.6.3 Panen sel MCF-7
, diamati kondisi sel pada keesokan harinya.
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada ruangan dengan LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, dicuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS Phosphate
Buffer Salin , ditambahkan 400 µL Tripsin-EDTA 0,25 secara merata,
kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
3.6.4 Penghitungan sel
selama ± 5 menit dan ditambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar
sel terlepas satu-satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol.
Ditransfer sel ke dalam tabung konikel.
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 µL panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Dihitung jumLah sel dibawah
mikroskop dengan menggunakan counter.
Universitas Sumatera Utara
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap
mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumLah sel per mL dengan
rumus: Σ selmL =
Σ sel A + Σ sel B + Σ sel C + Σ sel D 4
× 10
4
Hitung jumLah total sel yang diperlukan. Misal: untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumLah total sel
yang diperlukan adalah 1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1x 10 Hitung volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dengan rumus:
������ ������� ��� = JumLah total sel yang diperlukan
JumLah sel terhitungmL
6
Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan MK sampai total volume yang diperlukan.
3.7 Pembuatan Larutan Uji 3.7.1 Pembuatan seri konsentrasi larutan uji
Kategori