2.4.4 Kromatografi Kolom
Penggunaan kolom besar merupakan metode kromatografi untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar lebih dari 1 g. Campuran yang akan
dipisahkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap. Fase gerak dialirkan melalui kolom oleh gaya berat atau tekanan. Pita campuran bergerak melalui
kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi Gritter, dkk., 1991
Ukuran partikel penyerap untuk kolom dengan gaya tarik bumi biasanya lebih besar daripada untuk KLT, yaitu 63-250 µm; sedangkan untuk kolom
dengan tekanan biasanya lebih kecil daripada untuk KLT Gritter, dkk., 1991; Hostettman, dkk., 1995.
Karena memerlukan waktu yang lama dan bahan yang cukup banyak, perlu dipastikan campuran pelarut yang terbaik untuk pemisahan. Masalah ini dapat
dipecahkan melalui tiga pendekatan, antara lain, penelusuran pustaka, penerapan data KLT dan pemakaian elusi landaian Gritter, dkk., 1991.
Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama diperiksa dengan KLT digabungkan, diuapkan dengan tekanan rendah. Jika pelarut dan penyerap
murni, maka fraksi-fraksi pun murni. Namun mungkin masih diperlukan penghabluran ulang atau penyulingan kasar untuk memperoleh senyawa murni
Gritter, dkk., 1991
2.4.5 Kromatografi Cair Vakum
Cara ini pertama kali dipublikasikan oleh Coll, dkk pada tahun 1977 dengan menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek untuk
mengisolasi diterpena sembrenoida dari terumbu karang Australia. Kolom
Universitas Sumatera Utara
kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah
dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai.
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan penjerap dan dihisap perlahan-lahan kedalam
kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dari pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya
ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan
tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak Hostettmann, dkk., 1995.
2.5 Spektrofotometri Ultraviolet