dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 1000 µL, di vortex agar sampel terlarut sempurna kemudian di cukupkan dengan MK, kemudian dibuat pengenceran
selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 250 µgmL, 125 µgmL, 62,5 µgmL, 31,25 µgmL dan 15,625 µgmL semua pengenceran
dilakukan dengan menggunakan MK.
3.8 Uji Antikanker 3.8.1 Uji Sitotoksik
Sel MCF-7 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian
ditambahkan fraksi dan isolat pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan fraksi dan isolat dibuang kemudian sel dicuci dengan
PBS Sigma. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur
dan 10 μL MTT Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam
inkubator CO
2
3.8.2 Penghambatan Pada Siklus Sel Cell Cycle
5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan
selama satu malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Benchmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Adina, 2009.
Sel MCF-7 1x10
6
selsumuran dimasukkan dalam sumuran dengan jumLah 6 sumuran kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu sel diberikan
paparan dengan isolat dan doksorubisin dan kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam, sel-sel yang mengapung dan melekat dikumpulkan dengan cara
Universitas Sumatera Utara
memberikan tripsin 0,025 dan kemudian dipindahkan kedalam tabung konikel. sel dicuci sebanyak dua kali dengan 1 mL PBS dan disentrifugasi 2500 rpm
selama 5 menit, lapisan paling atas dibuang dan endapan dikumpulkan dan difiksasi dengan alkohol 70 dalam PBS pada suhu -20
o
C selama 2 jam. Sel yang telah difiksasi kemudian dicuci dengan PBS dingin sebanyak dua kali dan
diresuspensi dalam PBS dan di sentrifugasi 3000 rpm selama 3 menit, buang supernatan dan endapan ditambahkan larutan pewarna RNasePI kit, didiamkan 10
menit ditempat gelap pada suhu 37
o
3.8.3 Selectivity Index
C. Kemudian sampel dianalisa dengan menggunakan flow cytometer FACScan. Berdasarkan dari kandungan DNA akan
dihitung persentae sel pada setiap fase siklus sel G1S dan G2M yang dihitung dengan menggunakan Modfit Lt. 3.0.s Nugroho, et al., 2012.
Sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan
larutan uji pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma.
Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur dan 10 μL MTT
Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO
2
5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu
malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Nugroho, et al., 2012.
Universitas Sumatera Utara
Selectivity index dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:
����������� ����� = IC
50
Sel Vero IC
50
Sel MCF − 7
3.8.4 Analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D1 dengan Imunositokimia
