Sterilisasi Alat dan Bahan Pembuatan Larutan Uji .1 Pembuatan seri konsentrasi larutan uji Analisis Fraksi n-heksana secara KLT Fraksinasi Fraksi n-heksana dengan KCV Kromatografi Cair Vakum.

3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o

3.5 Pembuatan Media

C selama 15 menit Lay, 1994.

3.5.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute RPMI

Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L- glutamine tanpa NaHCO 3 Hepes 2 gram , netto 10,4 gram NaHCO 3 HCl 1N secukupnya 2 gram NaOH 1N secukupnya Aquabides steril sampai 1 liter Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO 3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu ditambahkan 800 mL aquabidest steril, dihomogenkan dengan menggunakan pengaduk magnet. Diukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan HCl 1N bila larutan basa atau NaOH 1N bila larutan asam, tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter vaccum di dalam ruangan dengan LAF Laminar Air Flow , dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date , dan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2 - 8 o C. Universitas Sumatera Utara

3.5.2 Pembuatan media kultur lengkap MK

Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-Streptomisin 2 Fungizone Amfoterisin B 0,5 RPMI ad 100 mL Cara Pembuatan: Semua bahan di atas dicampur dan dilakukan di dalam ruangan dengan LAF Laminar Air Flow, botol MK diberi label nama media, tanggal pembuatan, expire date , dan nama pembuat lalu disimpan pada suhu 2 - 8 o

3.6 Penumbuhan Sel MCF-7

C.

3.6.1 Penumbuhan sel

Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 mL media RPMI pada tabung konikel, diambil ampul dari freezer -80 o C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, diambil suspensi sel dalam ampul, dimasukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, dibuang supernatan dan tambahkan 4 mL MK RPMI dan resuspensi hingga homogen. Ditransfer masing-masing 2 mL ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 mL MK ke dalam masing-masing flask kultur dan dihomogenkan. Dimati kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu. Diberi identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO 2 . Universitas Sumatera Utara

3.6.2 Subkultur sel

Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, dilakukan pengerjaan pada LAF. Dilakukan proses panen sel dengan cara mengambil 500 µL panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 mL MK, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO 2

3.6.3 Panen sel MCF-7

, diamati kondisi sel pada keesokan harinya. Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua pekerjaan dilakukan pada ruangan dengan LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, dicuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS Phosphate Buffer Salin , ditambahkan 400 µL Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO 2

3.6.4 Penghitungan sel

selama ± 5 menit dan ditambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Ditransfer sel ke dalam tabung konikel. Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 µL panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Dihitung jumLah sel dibawah mikroskop dengan menggunakan counter. Universitas Sumatera Utara Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumLah sel per mL dengan rumus: Σ selmL = Σ sel A + Σ sel B + Σ sel C + Σ sel D 4 × 10 4 Hitung jumLah total sel yang diperlukan. Misal: untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumLah total sel yang diperlukan adalah 1x10 4 sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1x 10 Hitung volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dengan rumus: ������ ������� ��� = JumLah total sel yang diperlukan JumLah sel terhitungmL 6 Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan MK sampai total volume yang diperlukan. 3.7 Pembuatan Larutan Uji 3.7.1 Pembuatan seri konsentrasi larutan uji Fraksi ditimbang sebanyak 50 mg, 20 µL doksorubisin dan isolat ditimbang sebanyak 5 mg dalam politube, kemudian dilarutkan dalam Universitas Sumatera Utara dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 1000 µL, di vortex agar sampel terlarut sempurna kemudian di cukupkan dengan MK, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 250 µgmL, 125 µgmL, 62,5 µgmL, 31,25 µgmL dan 15,625 µgmL semua pengenceran dilakukan dengan menggunakan MK. 3.8 Uji Antikanker 3.8.1 Uji Sitotoksik Sel MCF-7 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10 4 selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan fraksi dan isolat pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO 2 5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan fraksi dan isolat dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur dan 10 μL MTT Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO 2

3.8.2 Penghambatan Pada Siklus Sel Cell Cycle

5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Benchmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Adina, 2009. Sel MCF-7 1x10 6 selsumuran dimasukkan dalam sumuran dengan jumLah 6 sumuran kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu sel diberikan paparan dengan isolat dan doksorubisin dan kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam, sel-sel yang mengapung dan melekat dikumpulkan dengan cara Universitas Sumatera Utara memberikan tripsin 0,025 dan kemudian dipindahkan kedalam tabung konikel. sel dicuci sebanyak dua kali dengan 1 mL PBS dan disentrifugasi 2500 rpm selama 5 menit, lapisan paling atas dibuang dan endapan dikumpulkan dan difiksasi dengan alkohol 70 dalam PBS pada suhu -20 o C selama 2 jam. Sel yang telah difiksasi kemudian dicuci dengan PBS dingin sebanyak dua kali dan diresuspensi dalam PBS dan di sentrifugasi 3000 rpm selama 3 menit, buang supernatan dan endapan ditambahkan larutan pewarna RNasePI kit, didiamkan 10 menit ditempat gelap pada suhu 37 o

3.8.3 Selectivity Index

C. Kemudian sampel dianalisa dengan menggunakan flow cytometer FACScan. Berdasarkan dari kandungan DNA akan dihitung persentae sel pada setiap fase siklus sel G1S dan G2M yang dihitung dengan menggunakan Modfit Lt. 3.0.s Nugroho, et al., 2012. Sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10 4 selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan larutan uji pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO 2 5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur dan 10 μL MTT Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO 2 5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Nugroho, et al., 2012. Universitas Sumatera Utara Selectivity index dihitung menggunakan persamaan di bawah ini: ����������� ����� = IC 50 Sel Vero IC 50 Sel MCF − 7

3.8.4 Analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D1 dengan Imunositokimia

Sel sebanyak 5x10 4 sumuran didistribusikan ke dalam plat 24 sumuran yang telah dilapisi coverslip pada bagian dasarnya, kemudian diinkubasi untuk pengadaptasian sel. Sel diberi perlakuan dengan senyawa isolat dan doksorubisin diinkubasi selama 24 jam. Pada akhir waktu inkubasi, sel dicuci dengan PBS kemudian ditambahkan metanol dingin, dilanjutkan inkubasi dalam freezer -4 o C selama 10 menit. Setelah itu, metanol dibuang dan coverslip yang memuat sel diletakkan pada dish bersih. Sel yang telah difiksasi dengan metanol kemudian dicuci dengan akuades 3 kali dan diinkubasi dengan larutan hidrogen peroksida blocking selama 10 menit pada temperatur kamar kemudian dibuang. Sel tersebut kemudian diinkubasi dengan prediluted blocking serum selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian dibuang. Setelah inkubasi, antibodi monoklonal kaspase 9 dan siklin D1 ditambahkan pada sel kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Coverslip kemudian dicuci dengan PBS dan ditetesi antibodi sekunder biotinylated universal secondary antibody dan kemudian diinkubasi selama 10 menit. Sel dicuci kembali menggunakan PBS dan ditetesi dengan streptavidin- enzim horse radish peroxidase dan diinkubasi selama 10 menit. Sel dicuci kemudian ditambahkan 3,3’-diaminobenzidin serta diinkubasi selama 5 menit sampai warna coklat. Sel dicuci lagi dengan PBS dan akuades kemudian dengan larutan Mayer-Haematoksilin dan diinkubasi selama 5 menit, selanjutnya sel dicuci kembali menggunakan akuades sampai bersih, ditambahkan etanol 70 inkubasi selama 2 menit, bersihkan, celupkan kedalam larutan xylol dan Universitas Sumatera Utara keringkan. Setelah kering, coverslip diletakkan di atas kaca obyek dan ditetesi mounting media serta ditutup dengan slide. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop yang dilengkapi dengan optiLab dan memakai Software Image Raster. Masing-masing sediaan diamati sembilan lapang pandang dengan sebaran merata Cho, et al., 2009. 3.9 Analisis Hasil Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik sel dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus: ����� = Absorbansi sel dengan perlakuan – Absorbansi kontrol media Absorbansi kontrol media Sel − Absorbansi kontrol media � 100 Aktivitas sitotoksik dinyatakan dalam IC 50

3.10 Analisis Fraksi n-heksana secara KLT

konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel yang dianalisis dengan analisis probit menggunakan SPSS 19. Terhadap fraksi n–heksana dilakukan analisis secara KLT menggunakan fase diam silika gel GF 254 Cara kerja: dan fase gerak campuran n-heksana – etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 dan 0:100. Sebagai penampak bercak digunakan pereaksi Liebermann-Burchard. Fraksi ditotolkan pada plat lapis tipis, kemudian dimasukan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap fase gerak. Setelah pengembangan selesai plat dikeluarkan dan dikeringkan, plat disemprot dengan penampak bercak dan Universitas Sumatera Utara Liebermann-Burchard dan dipanaskan di oven pada suhu 105°C selama 15 menit lalu diamati warna yang terbentuk.

3.11 Fraksinasi Fraksi n-heksana dengan KCV Kromatografi Cair Vakum.

Fraksi n-heksana difraksinasi dengan KCV menggunakan fase gerak landaian n-heksana - etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100 dan metanol 100 dan fase diam silika gel 60H. Cara kerja: Sebagai kolom digunakan corong Buchner kaca masir, kedalam corong Buchner kaca masir dimasukkan kertas saring sebagai alas bawah, lalu dimasukkan silika gel 60 H yang dikemas dalam keadaan kering, lalu diatasnya ditutup kembali dengan kertas saring. Alat vakum dihidupkan untuk memperoleh kerapatan yang maksimum. Kemudian cuplikan yang telah dicampur dengan silika gel 60 H diletakkan pada bagian atas kolom yang disebar secara merata, lalu di atasnya diletakkan kertas saring. Alat vakum dihidupkan kembali. Sampel dielusi dengan pelarut mulai dari kepolaran rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dan kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi Hostettmann, et al., 1995.

3.12 Analisis KLT Hasil KCV