Karakterisasi Isolat Kapang Endofit

38 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta e. Isolat DT1A1 Karakteristik makroskopik isolat DT1A1 meliputi; permukaan koloni berwarna hijau kebiruan dengan bagian tepi berwarna putih, warna sebalik hijau tua dengan bagian tepi berwarna putih kekuningan, diameter pertumbuhannya 2,01 cm pada hari ke-7 dan 3,98 cm pada hari ke-14. Karakteristik mikroskopik meliputi hifa bersekat dan bercabang, memiliki spora konidia bulat dan bertumpuk seperti anggur. Makroskopik Tampak Depan Hari Ke-7 Tampak Sebalik Hari Ke-7 Tampak Depan Hari Ke-14 Tampak Sebalik Hari Ke-14 Mikroskopik Perbesaran 400x Gambar 4.6 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DT1A1 39 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta f. Isolat DT1A2 Karakteristik makroskopik isolat DT1A2 meliputi; permukaan koloni berwarna abu muda, warna sebalik abu tua, koloninya memiliki garis-garis radial, dan diameter pertumbuhannya 1,7 cm pada hari ke-10 dan 2,22 cm pada hari ke- 14. Karakteristik mikroskopik meliputi hifanya bercabang dan tidak bersekat. Gambar 4.7 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DT1A2 Makroskopik Tampak Depan Hari Ke-10 Tampak Sebalik Hari Ke-10 Tampak Depan Hari Ke-14 Tampak Sebalik Hari Ke-14 Mikroskopik Perbesaran 200x 40 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta g. Isolat DT1B Hasil pengamatan karakteristik maskroskopik isolat DT1B meliputi; permukaan koloni berwarna abu, warna sebalik kuning kehijauan, koloni memiliki garis-garis radial dan diameter pertumbuhan koloni kapang 1,2 cm pada hari ke-7 dan 2,2 cm pada hari ke-14. Karakteristik mikroskopik meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang. Koloni memiliki sporangiospora. Makroskopik Tampak Depan Hari Ke-7 Tampak Sebalik Hari Ke-7 Tampak Depan Hari Ke-14 Tampak Sebalik Hari Ke-14 Mikroskopik Perbesaran 200x Gambar 4.8 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DT1B 41 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta h. Isolat DT3B Karakteristik makroskopik isolat DT3B meliputi; permukaan koloni berwarna putih, warna sebalik putih dengan bagian tengah berwarna coklat kuning, hifanya tipis memiliki tekstur seperti bulu, diameter pertumbuhannya 6,42 cm pada hari ke-7 dan 9 cm pada hari ke-14. Karakteristik mikroskopik meliputi hifa bersekat dan bercabang, dan memiliki konidiofor lurus, konidia berbentuk elips. Makroskopik Tampak Depan Hari Ke-7 Tampak Sebalik Hari Ke-7 Tampak Depan Hari Ke-14 Tampak Sebalik Hari Ke-14 Mikroskopik Perbesaran 200x Perbesaran 400x Gambar 4.9 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DT3B 42 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta i. Isolat DB2B Karakteristik makroskopik isolat DB2B meliputi; permukaan koloni berwarna putih seperti kapas, semakin lama pada bagian tengah koloni menjadi berwarna abu muda, warna sebalik hitam pada bagian tengah dengan putih pada sekelilingnya, diameter pertumbuhannya 5,62 cm pada hari ke-7 dan 8,12 cm pada hari ke-14. Karakteristik mikroskopik meliputi hifa bersekat. Makroskopik Tampak Depan Hari Ke-7 Tampak Sebalik Hari Ke-7 Tampak Depan Hari Ke-14 Tampak Sebalik Hari Ke-14 Mikroskopik Perbesaran 200x Gambar 4.10 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DB2B 43 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta j. Isolat DB3A Hasil pengamatan karakteristik maskroskopik isolat DB3A meliputi; permukaan koloni berwarna hitam dengan granul-granul kecil berwarna abu merata di atasnya, warna sebalik abu tua diikuti warna hijau pupus dengan tepi berwarna putih, dan diameter pertumbuhan koloni kapang 4,475 cm pada hari ke- 7 dan 6,52 cm pada hari ke-14. Karakteristik mikroskopik meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang. Koloni memiliki sporangiospora dengan bentuk bulat. Makroskopik Tampak Depan Hari Ke-7 Tampak Sebalik Hari Ke-7 Tampak Depan Hari Ke-14 Tampak Sebalik Hari Ke-14 Mikroskopik Perbesaran 400 x A: Sporangios pora B: Hifa Bersekat Gambar 4.11 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DB3A 44 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.4. Peremajaan Bakteri Uji

Peremajaan bakteri uji dilakukan dengan memindahkan biakan bakteri dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru. Peremajaan digunakan untuk mendapatkan bakteri yang aktif Machmud, 2001. Hal ini dikarenakan bakteri tersebut sebelumnya disimpan dalam keadaan inaktif di lemari pendingin Ciccyliona Nawfa, 2012. Media yang digunakan untuk peremajaan bakteri adalah Nutrient Agar NA. Nutrient Agar merupakan media yang sering digunakan untuk pertumbuhan bakteri. Media ini terdiri dari pepton dan beef extract sebagai nutrisi untuk pertumbuhan bakteri serta agar sebagai bahan pemadat. Beef extract mengandung senyawa-senyawa yang larut di dalam air termasuk karbohidrat, vitamin, nitrogen organik dan garam. Pepton merupakan sumber utama nitrogen organik. Arulanantham et al., 2012.

4.5. Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini mewakili bakteri patogen Gram positif dan Gram negatif, hal ini untuk mengetahui spektrum aktivitas antibakteri dari metabolit sekunder isolat kapang endofit. Identifikasi kemurnian ini bertujuan untuk mengamati morfologi dan kemurnian bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan adalah Escherichia coli dan Salmonella typhi yang mewakili bakteri Gram negatif dan Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis mewakili bakteri Gram positif. Dari pengamatan mikroskopis didapatkan sel bakteri Bacillus subtilis berbentuk batang, berwarna ungu dengan pewarnaan Gram dan merupakan bakteri Gram positif. Sel bakteri Staphylocccus aureus berbentuk bulat, berwarna ungu dan merupakan bakteri Gram positif. Bakteri Escherichia coli terlihat berbentuk batang pendek, berwarna merah dengan pewarnaan Gram dan merupakan bakteri Gram negatif, sedangkan sel bakteri Salmonella typhi berbentuk batang, berwarna merah dengan pewarnaan Gram dan merupakan bakteri Gram negatif. Hasil pengamatan mikroskopik bakteri uji dapat dilihat pada Lampiran 17 hal. 82. 45 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Identifikasi secara mikroskopik dilakukan dengan cara pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram digunakan untuk membedakan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif pada pewarnaan ini akan tetap berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah. Perbedaan warna antara bakteri Gram negatif dan Gram postif disebabkan oleh adanya perbedaan pada struktur dinding selnya. Dinding sel bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan yang tebal, sehingga kompleks Kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel tidak dapat tercuci oleh etanol sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida, dimana etanol dapat merusak lapisan lipopolisakarida, sehingga kompleks Kristal violet-iodin tercuci dan sel bakteri akan berwarna merah setelah diberi safranin Pratiwi, 2008.

4.6. Pembuatan Inokulum Bakteri Uji

Bakteri uji yang telah diremajakan diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0,9 lalu vortex hingga homogen. Kekeruhan suspensi bakteri disamakan dengan standar McFarland 3 10 9 CFUmL. Suspensi bakteri kemudian diencerkan sampai 10 6 CFUmL. Uji aktivitas antibakteri dilakukan pada jumlah bakteri 10 6 CFUmL karena jumlah mikroorganisme untuk menimbulkan infeksi klinik cukup 10 6 Darmawati, 2009.

4.7. Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Seleksi kapang endofit dilakukan terhadap 10 isolat yang didapatkan untuk mengetahui isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri. Gambar hasil uji seleksi kapang endofit dapat dilihat pada Lampiran 15 hal. 78. Dari proses seleksi terhadap 10 isolat kapang endofit diperoleh 4 isolat kapang endofit yag berpotensi sebagai antibakteri. Isolat DA3A1 menunjukkan zona bening terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Isolat DB3A menunjukkan zona bening terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Salmonella typhi. Isolat DT1A1 dan DT3B menunjukkan zona bening terhadap 46 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Empat isolat hasil seleksi yang berpotensi sebagai antibakteri selanjutnya dilakukan fermentasi. Tabel 4.2 Hasil Seleksi Kapang Endofit terhadap Bakteri Uji No Isolat Diameter zona hambat mm S.aureus B.subtilis E.coli S.typhi 1. DA3A1 - - 6,75 - 2. DB3A 7,6 9,8 - 12 3. DT1A1 8,2 - 10,25 - 4. DT3B 9,8 - 11,75 -

4.8. Fermentasi Kapang Endofit

Fermentasi bertujuan untuk menghasilkan sel kapang biomassa dalam jumlah banyak sehingga dapat mengoptimalkan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan. Proses fermentasi kapang endofit menggunakan media Potato Dextrose Yeast PDY sebanyak 300 mL terhadap isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri. Media Potato Dextrose Yeast PDY terdiri dari kentang, dan dextrose sebagai sumber karbon, serta yeast extract sebagai sumber nitrogen Kumala Pratiwi, 2014. Proses fermentasi dilakukan selama 21 hari pada suhu ruang secara statis. Proses fermentasi mengggunakan media PDY yang berupa media cair karena fermentasi dengan media cair lebih efektif untuk memproduksi biomassa dan lebih mudah dikerjakan secara aseptis Pokhrel Ohga, 2007. Selama proses fermentasi selama 21 hari terjadi perubahan warna pada media. Hal ini diduga adanya metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit yang jatuh ke dalam media fermentasi. Menurut Gandjar et al. 2006, pertumbuhan kapang endofit dapat diketahui dari penambahan masa sel dan proses metabolisme kapang yang menyebabkan timbulnya perubahan warna pada media cair. Metabolit sekunder yang dihasilkan dengan proses statis dapat diekstraksi dari biomassa miselium dan bagian media Pokhrel Ohga, 2007. Hasil proses fermentasi dapat dilihat pada Lampiran 16 hal. 81. 47 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.9. Ekstraksi Hasil Fermentasi

Hasil fermentasi setelah 21 hari dari masing-masing isolat dipisahkan bagian biomassa dan media untuk dilakukan proses ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan tujuan untuk menarik senyawa metabolit sekunder hasil fermentasi yang terdapat dalam isolat kapang endofit. Proses ekstraksi bagian biomassa dilakukan dengan cara ekstraksi secara dingin yaitu dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Maserasi merupakan metode ekstraksi yang sederhana dengan merendam bahan dengan pelarut selama beberapa hari pada temperatur ruang dan terhindar dari cahaya matahari Damayanti dan Fitriani, 2012. Keuntungan metode ini adalah peralatan yang digunakan sederhana Damayanti dan Fitriani, 2012. Bagian biomassa dihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang dan alu agar struktur sel pecah sehingga memudahkan zat aktif terekstraksi oleh pelarut. Ukuran yang semakin kecil akan meningkatkan luas permukaan sehingga proses ekstraksi akan semakin efektif Handa et al., 2008. Proses maserasi dilakukan berulang kali hingga tidak terdapat lagi senyawa yang tertarik oleh pelarut yang ditandai dengan warna pelarut menjadi bening. Maserat yang didapat kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental metanol EM. Bagian media yang telah dipisahkan dari biomassa dilakukan partisi cair- cair menggunakan pelarut etil asetat dan n-heksan. Metode ini merupakan pemisahan komponen kimia diantara dua fase pelarut yang tidak saling bercampur. Komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua fase sesuai dengan tingkat kepolarannya Gu, 2000. Hasil partisi diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat. Masing-masing fraksi kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana EH dan ekstrak kental Etil asetat EE. Perolehan berat ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 18 hal. 83 dan organoleptis ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.3 48 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.3 Organoleptis Ekstrak Isolat Ekstrak Organoleptis DA3A1 Metanol Coklat kehitaman, kental Etil Asetat Orange kekuningan, kental Heksana Putih kecoklatan, kental DB3A Metanol Coklat, kental Etil Asetat Coklat kekuningan, kental Heksana Putih susu, kental DT1A1 Metanol Merah kehitaman, kental Etil Asetat Coklat kemerahan, kental Heksana Putih susu, kental DT3B Metanol Hijau kehitaman, kental Etil Asetat Coklat kehitaman, kental Heksana Coklat muda, kental Ekstrak kental metanol EM, ekstrak kental n-heksana EH, dan ekstrak kental Etil asetat EE dibuat konsentrasi 1000 ppm. Masing-masing konsentrasi dari ekstrak dan fraksi air dilakukan uji aktivitas antibakteri.

4.10. Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri pada isolat kapang endofit dilakukan dengan metode difusi agar. Metode ini merupakan salah satu metode kualitatif uji aktivitas antibakteri yang hanya akan memberikan gambaran tentang ada atau tidaknya aktivitas antibakteri dari zat tersebut Valgas et al., 2007. Bakteri uji yang digunakan yaitu, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Bacillus subtilis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 4 isolat yang difermentasi memperlihatkan aktivitas yang berbeda-beda terhadap bakteri uji. Gambar hasil uji aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Lampiran 19 hal. 84. Pada penelitian ini digunakan cakram dengan diameter 6 mm. Masing- masing ekstrak yang diperoleh ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol dibuat 49 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm. Sebanyak 20 µl larutan uji diserapkan ke cakram hingga cakram mengering. Pengeringan ini bertujuan agar senyawa metabolit sekunder terserap secara merata pada cakram dan pelarut yang digunakan menguap. Kontrol positif yang digunakan adalah kloramfenikol. Tujuan digunakannya kontrol positif adalah sebagai pembanding dari zona hambat yang terbentuk dari ekstrak uji. Kontrol negatif yang dipakai adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan masing-masing ekstrak yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol serta akuades. Tujuan penggunaan masing-masing pelarut sebagai kontrol negatif adalah untuk membuktikan bahwa pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak tidak berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri. Berikut adalah hasil pengukuran zona hambat isolat kapang endofit: Table 4.4 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Isolat Ekstrak Diameter zona hambat mm E.coli S.typhi S.aureus B.subtillis DT1A1 Metanol n-heksana Etil asetat Air 6,8 7,3 - - 12,9 - 10,9 - 7,9 - - - - 10,2 - - DA3A1 Metanol n-heksana Etil Asetat Air 6,5 7,15 - - 8,7 - 8,3 - 7,9 - - - - 9,6 - - DT3B Metanol n-heksana Etil Asetat Air 7,4 6,97 - - 14,7 - 10,7 - 8,3 - - - - - - - DB3A Metanol n-heksana Etil Asetat Air 6,6 6,4 - - 10,1 - - - 6,4 - - - - 9 - - Kontrol - Metanol n-heksana Etil Asetat Air - - - - - - - - - - - - - - - - Kontrol + Kloramfenikol 25,5 25,2 17,05 32