26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dan dibiarkan dingin sebelum digunakan. Preparat sampel disiapkan dalam bentuk suspensi di atas kaca objek lalu difiksasi dengan melewatkan kaca objek pada api
bunsen. Preparat kemudian diwarnai dengan larutan kristal violet 0,5 dan
dibiarkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air mengalir selama 5 detik, diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit, lalu dicuci kembali dengan
air mengalir. Preparat kemudian dibilas dengan etanol 96 selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol, lalu dicuci dengan air mengalir. Preparat
selanjutnya diteteskan larutan safranin selama 45 menit. Dicuci kembali dengan air mengalir. Preparat dikeringkan dengan cara diletakkan di atas tisu steril dan
diamati dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar
Kumala et al., 2006.
3.3.8 Pembuatan Inokulum Bakteri Uji
Suspensi bakteri dibuat dengan cara, satu ose masing-masing bakteri uji pada media agar NA miring yang telah diinkubasi selama 24 jam diinokulasikan
ke dalam larutan 9 mL NaCl 0,9. Kekeruhannya diseragamkan dengan menggunakan standar McFarland 3 10
9
CFUmL Noverita et al., 2009. Suspensi bakteri 10
9
CFUmL kemudian diencerkan sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
6
CFUmL. Pengenceran dilakukan dengan cara dari suspensi bakteri 10
9
dipipet 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
8
CFUmL. Suspensi bakteri 10
8
dipipet 1mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9, sehingga diperoleh
suspensi bakteri 10
7
CFUmL. Dari suspensi bakteri 10
7
diambil 1 mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri
10
6
CFUmL Andidha, 2015.
3.3.9 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri
Seleksi kapang
endofit penghasil
antibakteri dilakukan
dengan menginokulasikan satu potongan agar isolat kapang murni yang berumur 7-14 hari
ke media MHA yang telah mengandung bakteri uji. Masing-masing kultur
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengandung 10
6
CFUmL bakteri uji. Kultur diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Aktivitas antibakteri kapang endofit dilihat dari zona hambat yang
terbentuk disekitar potongan isolat kapang Elfina et al., 2014. Isolat yang menunjukkan zona hambat dipilih untuk dilakukan fermentasi.
3.3.10 Fermentasi Kapang Endofit
Fermentasi dilakukan dengan fermentasi cair menggunakan media Potato Dextrose Yeast PDY Kumala Pratiwi, 2014. Koloni kapang murni penghasil
zona hambat yang berumur 7-14 hari Radji et al., 2011 diambil sebanyak 3 potongan biakan kapang menggunakan sedotan steril lalu diinokulasikan ke dalam
media fermentasi cair PDY. Volume media yang diisikan ke dalam botol fermentasi adalah 300 mL Radji et al., 2011. Setiap isolat dilakukan fermentasi
secara triplo. Selanjutnya diinkubasi secara statis selama 21 hari pada suhu ruang Phongpaichit et al., 2006.
3.3.11 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Hasil fermentasi yang diperoleh disaring menggunakan kertas saring untuk memisahkan biomassa dan media. Bagian media dilakukan partisi dengan pelarut
n-heksan. Hasilnya akan diperoleh dua bagian yaitu fraksi n-heksana dan fraksi air. Fraksi n-heksana yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator dan
didapatkan ekstrak kental n-heksana EH. Fraksi air yang didapat dipartisi kembali menggunakan pelarut etil asetat. Hasilnya akan diperoleh fraksi etil asetat
dan fraksi air FA. Fraksi etil asetat dipekatkan menggunakan rotary evaporator
hingga didapatkan ekstrak kental etil asetat EE.
Bagian biomassa yang didapat dari hasil fermentasi dihaluskan menggunakan lumpang dan alu, kemudian diekstraksi dengan pelarut metanol.
Maserat yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator dan diperoleh ekstrak kental metanol EM.
