24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sampel daun lalu direndam ke dalam etanol 70 selama 1 menit, kemudian direndam dalam larutan NaOCl 5,25 selama 5 menit, lalu direndam kembali ke
dalam etanol 70 selama 30 detik dan terakhir dibilas dengan akuades steril selama 3-5 detik Radji et al., 2011. Potongan daun yang telah disterilisasi
kemudian diletakkan di atas kertas saring Goveas et al., 2011. Potongan daun lalu dipotong menjadi bagian yang lebih kecil dengan ukuran ±1x1 cm
2
dengan pisau steril Phongpaichit et al., 2006.
Potongan daun ditempatkan pada cawan petri yang berisi media PDA. Penanaman sampel dilakukan triplo dan tiap cawan berisi dua potongan daun.
Media yang telah diinokulasi dengan potongan daun diinkubasi pada suhu ruang
selama 14 hari Noverita et al., 2009. Akuades bilasan terakhir diambil dan
diisolasi ke PDA lainnya. Perlakuan ini berfungsi sebagai kontrol sterilisasi permukaan daun Bahgat et al., 2014. Semua proses sterilisasi hingga proses
isolasi dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow Noverita et al., 2009.
3.3.4 Pemurnian Kapang Endofit
Kapang endofit yang telah tumbuh di media PDA kemudian dimurnikan ke dalam media PDA baru dengan cara menginokulasi sedikit hifa dengan ose steril
dari setiap koloni endofit yag berbeda. Kultur kapang endofit diinkubasi selama 14 hari pada suhu ruang Radji et al., 2011. Pemurnian dilakukan berdasarkan
perbedaan secara makroskopis yaitu warna dan bentuk koloni kapang Ariyono et al., 2014.
Pengamatan morfologi dilakukan selama 7-14 hari dan apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang berbeda secara makroskopis, maka
dilakukan pemurnian ulang hingga diperoleh isolat murni. Setiap isolat yang didapat dibuat duplo sebagai working culture dan stock culture Noverita et al.,
2009. Stock culture diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari, kemudian disimpan pada suhu 4
o
C sebagai kultur cadangan Kumala, 2014.
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.5 Karakterisasi Isolat Kapang Endofit
Karakterisasi dari kapang endofit dilakukan dengan mengamati morfologinya baik secara makroskopik maupun mikroskopik. Pengamatan
karakteristik makroskopik dilakukan dengan mengamati warna koloni, warna sebalik, permukaan koloni granular, seperti tepung, menggunung, licin, ada atau
tidak tetes-tetes eksudat, diameter pertumbuhan koloni kapang, dan lingkaran- lingkaran konsentris Kumala, 2014.
Pengamatan mikroskopik dilakukan menggunakan mikroskop. Pembuatan preparat untuk pengamatan menggunakan mikroskop yaitu dengan cara pada kaca
objek yang telah disterilisasi dalam cawan, diteteskan media PDA steril dan didiamkan hingga memadat. Diletakkan sedikit hifa dengan ose pada media. Kaca
objek lalu ditutup dengan cover glass. Cawan petri yang sebelumnya telah diberi alas kertas tisu steril dibasahi dengan akuades steril. Preparat diinkubasi selama 5-
7 hari pada suhu ruang lalu cover glass dilepaskan, ditetesi dengan 1 tetes etanol 70 dan 1 tetes methylen blue, kemudian ditutup dengan cover glass dan diamati
dengan mikroskop dari perbesaran terkecil hingga terbesar Kumala, 2014; Sundari, 2012. Pengamatan yang dilakukan meliputi ada atau tidaknya sekat pada
hifa, pertumbuhan hifa bercabang atau tidak bercabang, ada tidaknya konidia, dan bentuk konidia Ariyono et al., 2014.
3.3.6 Peremajaan Bakteri Uji
Bakteri uji Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis diinokulasikan masing-masing sebanyak satu ose pada media
agar NA miring, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C Jauhari,
2010.
3.3.7 Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji
Identifikasi kemurnian bakteri uji dilakukan secara mikroskopik pada bakteri uji yang berusia 24 jam. Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan
metode Pewarnaan Gram. Langkah metode pewarnaan Gram adalah kaca objek dibersihkan terlebih dahulu dengan etanol 70, kemudian dilewatkan di atas api
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dan dibiarkan dingin sebelum digunakan. Preparat sampel disiapkan dalam bentuk suspensi di atas kaca objek lalu difiksasi dengan melewatkan kaca objek pada api
bunsen. Preparat kemudian diwarnai dengan larutan kristal violet 0,5 dan
dibiarkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air mengalir selama 5 detik, diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit, lalu dicuci kembali dengan
air mengalir. Preparat kemudian dibilas dengan etanol 96 selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol, lalu dicuci dengan air mengalir. Preparat
selanjutnya diteteskan larutan safranin selama 45 menit. Dicuci kembali dengan air mengalir. Preparat dikeringkan dengan cara diletakkan di atas tisu steril dan
diamati dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar
Kumala et al., 2006.
3.3.8 Pembuatan Inokulum Bakteri Uji
Suspensi bakteri dibuat dengan cara, satu ose masing-masing bakteri uji pada media agar NA miring yang telah diinkubasi selama 24 jam diinokulasikan
ke dalam larutan 9 mL NaCl 0,9. Kekeruhannya diseragamkan dengan menggunakan standar McFarland 3 10
9
CFUmL Noverita et al., 2009. Suspensi bakteri 10
9
CFUmL kemudian diencerkan sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
6
CFUmL. Pengenceran dilakukan dengan cara dari suspensi bakteri 10
9
dipipet 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
8
CFUmL. Suspensi bakteri 10
8
dipipet 1mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9, sehingga diperoleh
suspensi bakteri 10
7
CFUmL. Dari suspensi bakteri 10
7
diambil 1 mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri
10
6
CFUmL Andidha, 2015.
3.3.9 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri
Seleksi kapang
endofit penghasil
antibakteri dilakukan
dengan menginokulasikan satu potongan agar isolat kapang murni yang berumur 7-14 hari
ke media MHA yang telah mengandung bakteri uji. Masing-masing kultur
