34
Meter Lab 850 SI Analytics, dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.
F. Tata Cara Penelitian
1.
Pembuatan asam fosfat H
3
PO
4
0,1 M
Larutan pekat H
3
PO
4
85 diambil sebanyak 0,3 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, kemudian ditambahkan akua demineralisata
hingga tanda batas sehingga konsentrasi H
3
PO
4
menjadi 0,1 M.
2. Pembuatan bufer fosfat 0,01M
Larutkan 0,68 g kalium fosfat monobasa KH
2
PO
4
dalam 500 mL akua demineralisata. Atur pH hingga mencapai pH 3 dengan penambahan
asam fosfat 0,1 M.
3. Pembuatan fase gerak
Fase gerak dibuat dengan mencampurkan metanol dan 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 oleh sistem KCKT. Sebelumnya
larutan 0,01 M bufer fosfat pH 3 tersebut disaring dengan penyaring Whatman 0,45 µm yang dibantu dengan pompa vakum kemudian didegassing
selama 15 menit menggunakan ultrasonicator. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
4. Pembuatan larutan kerja asam askorbat
a. Pembuatan larutan stok asam askorbat
Timbang saksama 20 mg asam askorbat dan dilarutkan dalam metanol : bufer fosfat pH 3 40 : 60 hingga 10,0 mL sehingga konsentrasi lebih
kurang 2000 µgmL. b.
Pembuatan larutan intermediate asam askorbat 100 µgmL. Sebanyak 1,25 mL larutan stok diambil dan diencerkan dalam
metanol:bufer fosfat pH 3 40 : 60 hingga 25,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan intermediate lebih kurang 100 µgmL.
5. Penetapan panjang gelombang λ maksimum asam askorbat
Dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 40; 50; dan 60 µgmL dengan mengencerkan 4,0; 5,0; dan 6,0 mL larutan stok menggunakan
fase gerak hingga 10,0 mL. Masing-masing konsentrasi larutan seri baku asam askorbat 40; 50;
dan 60 µgmL discan pada panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV. Nilai
λ maksimum merupakan λ yang memberikan
serapan terbesar dan sama pada tiap konsentrasi.
6. Pembuatan kurva baku asam askorbat
Larutan intermediate asam askorbat diambil sebanyak 250, 375, 500, 625, dan 750 µ L lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL. Selanjutnya
ditambahkan pelarut metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 40 : 60 hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi lebih kurang sebesar 50, 75, 100,
36
125, dan 150 µgmL. Larutan disaring dengan millipore 0,45 µm dan
dimasukkan ke dalam vial KCKT.
Larutan seri baku asam askorbat masing-masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak 20 µ L pada sistem KCKT fase terbalik. Luas puncak
asam askorbat untuk masing-masing konsentrasi seri larutan baku didapatkan dari kromatogram yang dihasilkan. Pembuatan kurva baku dilakukan dalam
tiga kali replikasi. Luas puncak digunakan untuk menghitung regresi linear dengan persamaan y = bx + a dengan kriteria keberterimaan r
≥ 0,998 Kazakevich and Lobrutto, 2007.
7. Pengujian stabilitas baku pembanding asam askorbat
