15
digunakan untuk evaluasi stabilitas asam askorbat dalam sediaan farmasetis dan kosmetik Mitic dkk., 2011.
D. Spektrofotometri UV
Instrumentasi yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang disebut spektrometer
atau spektrofotometer. Spektrofotometri merupakan teknik analisis spektroskopik yang menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dengan memakai
instrumen spektrofotometer
Mulja dan
Suharman, 1995.
Radiasi elektromagnetik dapat dianggap sebagai energi yang merambat dalam bentuk
gelombang. Jika suatu molekul dikenai suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul tersebut meningkat ke level yang
lebih tinggi maka akan terjadi peristiwa penyerapan energi oleh molekul. Energi yang berpindah dari suatu tingkat ke tingkat yang lebih tinggi disebut dengan
transisi. Keadaan energi yang lebih rendah disebut keadaan dasarground state, setelah mengalami transisi energi molekuler ini akan meningkat dan berada pada
keadaan tereksitasiexcited state Gandjar dan Rohman, 2007. Molekul-molekul yang memerlukan energi lebih banyak untuk
mengeksitasikan elektron akan menyerap panjang gelombang yang lebih pendek, sedangkan untuk molekul-molekul yang memerlukan energi lebih sedikit untuk
mengeksitasikan elektron akan menyerap panjang gelombang yang lebih panjang Fessenden and Fessenden, 1997.
16
Gambar 4. Skema eksitasi elektron Gandjar dan Rohman, 2007
Absorbsi sinar UV dan sinar tampak pada umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan, akibatnya panjang gelombang pita yang
mengabsorbsi dapat dihubungkan dengan ikatan yang mungkin ada dalam suatu molekul Gandjar dan Rohman, 2007. Elektron yang terlibat pada penyerapan
radiasi ultraviolet ini ada tiga yaitu elektron sigma σ, elektron phi π, dan
elektron bukan ikatan n. Elektron σ adalah elektron yang terlibat dalam pembentukkan ikatan tunggalsingle bond
. Ikatan rangkap melibatkan elektron σ dan satu ikatan lagi dari
elektron π akibat dari adanya tumpang tindih pada orbital atom p. Selain elektron-elektron yang membentuk ikatan, terdapat eletron yang
tidak membentuk ikatannon bonding electron dengan simbol n Skoog, 1985. Elektron-elektron yang tereksitasi disebut antibonding electron
dengan simbol π dan σ. Terdapat empat jenis transisi, dua diantaranya yang paling banyak
dijumpai adalah n→π dan π→π. Kedua transisi ini merupaka transisi yang paling cocok untuk analisis sebab sesuai dengan panjang gelombang antara 200-
700 nm dan secara teknis panjang gelombang ini dapat diaplikasikan pada spektrofotometer.
17
G
ambar 5 . Contoh transisi π →π pada keton Christian, 2004.
Senyawa yang secara spesifik bertanggung jawab atas absorpsi disebut kromofor dan biasanya merupakan sistem terkonjugasi. Senyawa yang tidak
menghasilkan serapan tetapi mempengaruhi spektra serapan ketika terikat pada kromofor disebut auksokrom Moffat dkk., 2011. Contoh auksokrom adalah
gugus hidroksil, gugus amino, dan halogen. Ikatan terkonjugasi adalah keadaan dimana ikatan rangkap terpisahkan oleh satu ikatan tunggal atau berselang-seling
antara ikatan rangkap dan ikatan tunggal Christian, 2004. Adanya ikatan terkonjugasi dalam senyawa akan mempengaruhi panjang gelombang
maksimalnya. Semakin panjang ikatan terkonjugasinya, maka akan semakin besar panjang gelombang maksimalnya Gandjar dan Rohman, 2007.
Radiasi cahaya yang masuk melalui monokromator akan melewati sampel dan terjadi penyerapan sejumlah radiasi, sehingga radiasi yang keluar dan
ditangkap oleh detektor akan lebih kecil dari radiasi yang masuk. Banyaknya jumlah radiasi yang berkurang berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam
sampel. Jumlah radiasi yang diserap oleh molekul-molekul disebut serapan Harvey, 2000. Menurut Skoog, West, dan Holler 1994, serapan A berbanding
lurus dengan konsentrasi analit c dan tebal kuvet b, dan dipengaruhi konstanta absorptivitas a yang dinyatakan dalam persamaan Lambert-Beer:
18
A = a b c 1
Ketika b dinyatakan dalam cm dan c dinyatakan dalam molL maka a disebut juga absorptivitas molar
ɛ sehingga persamaannya menjadi: A =
ɛ b c 2
Keterangan : A = serapan
ɛ = absorptivitas molar M
-1
cm
-1
b = tebal kuvet cm c = konsentrasi molekul dalam senyawa analit M
Harris, 1995. Jika konsentrasi molekul zat analit dinyatakan dalam satuan persen
beratvolume g100 mL, maka absorptivitas a dapat ditulis dengan .
Hubungan antara dengan absorptivitas molar
ɛ dapat dilihat pada persamaan 3.
3
Keterangan : ɛ = absorptivitas molar M
-1
cm
-1
= absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi g100mL BM = bobot molekul gmol
Gandjar dan Rohman, 2007.
Nilai memberikan manfaat untuk mengetahui berapa besar
konsentrasi senyawa asam askorbat yang harus dipersiapkan sehingga diperoleh serapan pada kisaran 0,2-0,8. Selain itu, manfaat dari informasi nilai
adalah terkait dengan sensitivitas senyawa untuk diukur dengan spektrofotometer UV.
Semakin besar nilai suatu senyawa maka semakin sensitif senyawa tersebut
untuk dideteksi dan diukur dengan spektrofotometer UV. Nilai asam
askorbat adalah 556a pada pelarut asam dan deteksi pada λ 243 nm Moffat dkk.,
19
2011. Absorptivitas molar yang dapat terbaca pada panjang gelombang 200-700 nm
dengan transisi π→π menggunakan spektrofotometer UV berkisar antara 1.000-100.000 Christian, 2004.
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kategori