26
Kondisi pemisahan kromatografi cair-cair dapat diatur dengan variasi fase gerak dengan mengatur kekuatan pelarutsolvent strength. Pada
KCKT fase terbalik kekuatan pelarut ini tergantung pada pelarut organik yang disebut juga modifier Christian, 2004. Fase gerak yang sering digunakan
pada KCKT fase terbalik adalah campuran metanol dan asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer Gandjar dan Rohman., 2007. Kekuatan pelarut
merupakan total seluruh jenis interaksi molekular yang terjadi antara lain dispersi, orientasi, dan ikatan hidrogen. Kekuatan pelarut akan semakin tinggi
saat terdapat interaksi yang baik antara pelarut dan analit Wilard, Merritt, Dean, and Settle, 1988.
Setiap fase gerak memiliki nilai panjang gelombang UV cut-off yang berbeda-beda. Nilai UV cut-off merupakan panjang gelombang dimana
pelarut akan memberikan absorbansi lebih dari satu satuan absorbansi. Hal ini sangat penting terutama bila pada sistem KCKT menggunakan detektor UV-
Vis atau detektor fluorometri. Sangat dianjurkan untuk menghindari penggunaan pelarut yang memiliki panjang gelombang UV cut-off yang mirip
dengan panjang gelombang deteksi Gandjar dan Rohman, 2007.
3. Fase Diam
Pada kromatografi cair modern, hampir seluruh pemisahan fase terbalik menggunakan adsorban yang dimodifikasi secara kimia. Adsorban
yang beredar kebanyakan diberi nama berdasarkan struktur kimia permukaannya, sedangkan material dasarnya sering tidak disebutkan.
27
Material dasar yang paling sering digunakan adalah silika SiO
2
. Tujuan utama modifikasi kimiawi pada preparasi material fase diam terbalik
reversed phase material adalah untuk mengubah permukaan material dasar yang bersifat polar menjadi nonpolar. Fase terikat yang paling banyak
digunakan adalah fase terikat tipe alkil C
1
-C
18
; C
30
. Pada KCKT fase terbalik, modifikasi silika gel dilakukan dengan menutup gugus silanol -
SiOH dengan suatu bagian organik yang umumnya adalah suatu hidrokarbon rantai panjang untuk menghilangkan gugus hidroksil melalui reaksi silanisasi.
Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika maka akan semakin
hidrofobik Kazakevich
and Lobrutto,
2007. Reaksi
pengikatanbonding rantai organik pada gugus silanol dapat dilihat dari Gambar 9 dimana X sering kali berupa
–Cl atau –OEt, danatau –CH
3
yang memberikan hasil sampingan berupa HCl atau etanol Snyder dkk., 2010.
Gambar 9. Reaksi pembentukkan fase terikat silika Snyder dkk., 2010.
pH fase gerak mempengaruhi stabilitas Si —O—Si yang
menyebabkan ikatan tersebut terhidrolisis pada pH 7 dan menyebabkan degradasi fase diam yang serius Wilard, Merritt, Dean, and Settle, 1988.
Kebanyakan fase diam dengan penyusun silika memiliki rentang pH yang dapat ditoleransi, yaitu pH 2-7. Dampak lain yang dapat dilihat adalah
terbentuknya puncak yang asimetris akibat adanya interaksi antara bentuk ion zat analit dengan residu silanol Kazakevich and Lobrutto, 2007.
28
4. Larutan Bufer
pH merupakan faktor yang penting dalam metode KCKT. Selektivitas pemisahan senyawa yang dapat atau mudah terion dapat
diaturdisesuaikan dengan memanipulasi pH. Faktor retensi dari bentuk tak- terion non-ionized suatu analit dapat mencapai 30 kali lebih besar dari
bentuk terionnya, hal ini dapat diatasi dengan mengatur pH fase gerak. Pengaturan pH ini dapat dilakukan dengan menggunakan larutan bufer
dengan kapasitas bufer yang baik untuk menghindari fluktuasi yang tinggi pada waktu retensi Ahuja and Dong, 2005. Larutan bufer atau larutan
penyangga adalah larutan yang dapat mempertahankan pH dari pengenceran,
penambahan sedikit asam atau sedikit basa Ashari, 2006.
Kapasitas bufer merupakan kemampuan suatu bufer untuk mempertahankan pH, tergantung pada nilai pKa, konsentrasi bufer, dan pH
fase gerak. Kapasitas bufer akan menurun ketika ada perbedaan nilai pKa bufer dengan pH fase gerak yang diinginkan. Persyaratan utama pemilihan
larutan bufer adalah memiliki nilai pKa yang berada dalam rentang ± 1 ,0 unit dari pH fase gerak yang diinginkan. Salah satu bufer yang sering digunakan
dalam analisis dengan detektor UV dan pH fase gerak ≤ 8 adalah bufer fosfat.
Bufer ini memiliki nilai pKa = 2,1 25
o
C dengan rentang bufer 1,5 – 3,5
Snyder dkk., 2010.
5. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
