TEKNIK ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN

13

2.6 TEKNIK ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN

Elektroforesis didefinisikan sebagai migrasi molekul atau partikel bermuatan di dalam larutan atau medium karena adanya pengaruh medan listrik Nielsen, 2003. Migrasi partikel bermuatan tersebut dapat terjadi karena perbedaan muatan total, ukuran, dan bentuk partikel Pomeranz dan Meloan, 1994. Metode analisis elektroforesis protein merupakan metode analisis yang memisahkan molekul protein berdasarkan berat molekulnya Bolag dan Edelstein, 1991. Copeland 1994 menyebutkan bahwa teknik elektroforesis telah banyak digunakan dalam analisis protein untuk menentukan tingkat kemurnian sampel, berat molekul, maupun titik isoelektrik. Selain itu, menurut Nielsen 2003 teknik elektroforesis juga sering digunakan untuk menentukan komposisi protein dari suatu produk pangan. Sebagai contoh, dalam penentuan komposisi konsentrat protein kedelai dan konsentrat protein whey. Pemisahan protein berdasarkan muatannya tergantung pada karakter asam dan basa protein. Hal ini ditentukan oleh jumlah dan jenis rantai samping gugus R yang dapat terionisasi dalam rantai polipeptida serta pH lingkungan. Pada pH lingkungan yang lebih besar daripada pH isoelektriknya pI, protein akan memiliki muatan negatif sehingga migrasi protein akan menuju anoda yang bermuatan positif. Sebaliknya, bila pH lingkungan di bawah pI, muatan protein menjadi positif yang membuatnya akan bermigrasi menuju katoda yang bermuatan negatif Autran, 1996. Hal inilah yang menjadi dasar pemisahan protein dengan elektroforesis. Metode elektroforesis protein yang paling umum dan banyak dilakukan adalah SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. SDS-PAGE merupakan teknik elektroforesis dalam sistem buffer diskontinyu yang menggunakan dua tipe gel sebagai medianya, yaitu stacking gel dan separating gel. Sistem buffer yang diskontinyu membuat sampel terkonsentrasi dalam stacking gel sehingga menghasilkan resolusi yang lebih baik ketika pemisahan protein terjadi di separating gel Garfin, 1990. Skema alat elektroforesis SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 6. Garfin 1990 menambahkan, resolusi yang dihasilkan melalui SDS-PAGE tergantung dari ukuran pori-pori polimer gel, sehingga persentase akrilamid yang digunakan pada tahap persiapan gel akan mempengaruhi kemampuan elektroforesis dalam memisahkan protein. Gambar 6 . Skema alat SDS-PAGE Jage, 2008 Gel poliakrilamid dibentuk dari hasil ko-polimerisasi monomer akrilamid, CH 2 =CH-CO-NH 2 , dengan bantuan senyawa yang bertindak sebagai cross-linking agent, yaitu N,N’-metilen-bisakrilamid, CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-COCH=CH 2 . Mekanisme polimerisasi akrilamid tersebut dikatalisis oleh TEMED tetrametietilendiamin dan APS amonium persulfat. TEMED akan menyebabkan pembentukan radikal bebas dari amonium persulfat yang mengakibatkan reaksi pembentukan 14 akrilamid aktif. Akrilamid aktif ini akan bereaksi dengan akrilamid lainnya membentuk rantai polimer yang panjang. Hasil dari polimerisasi ini adalah terbentuknya gel dengan struktur jala dari rantai akrilamid. Ukuran pori dan jala gel tersebut ditentukan oleh jumlah akrilamid yang digunakan per unit volumnya dan derajat ikatan silangnya Autran, 1996; Garfin, 1990. Sodium dodecyl sulfate SDS adalah detergen anionik yang paling umum digunakan dalam elektroforesis. SDS memiliki dua fungsi, yaitu: 1 untuk memisahkan protein-protein yang beragregasi, hidrofobik, atau memiliki kelarutan yang rendah, seperti membran protein; dan 2 memisahkan protein berdasarkan bentuk, ukuran dan berat molekulnya. SDS menyelimuti protein dengan muatan negatif, serta mengikat protein dengan rasio yang konstan, yaitu 1.4 g SDS per gram polipeptida Autran, 1996; Garfin, 1990. Interaksi SDS dengan protein akan merusak seluruh ikatan non-kovalen protein sehingga struktur protein akan terbuka. Selanjutnya, penggunaan reducing agent seperti 2-merkaptoetanol atau ditiothreitol akan membantu mendenaturasi protein melalui pemutusan ikatan disulfida pada protein sehingga memecahnya menjadi subunit-subunit protein. Akibatnya, mobilitas elektroforetik dari kompleks detergen-polipeptida hanya merupakan fungsi dari berat molekul protein Garfin, 1990. Penggunaan buffer dalam elektroforesis gel dapat digunakan dengan dua sistem, yaitu kontinyu homogenous dan diskontinyu multiphasic Copeland, 1994. Perbedaan mendasar pada sistem diskontinyu adalah penggunaan dua gel dalam satu slab, yaitu stacking gel dan separating gel. Buffer dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua jenis gel tersebut berbeda Boyer, 1993. Pada stacking gel digunakan buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid yang lebih rendah ukuran pori besar sedangkan pada separating gel digunakan buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid yang tinggi ukuran pori kecil Wilson dan Walker, 2000. Hal ini akan menghasilkan pemisahan yang baik dengan pita yang tajam karena protein terkonsentrasi pada stacking gel dan mengalami resolusi yang tinggi pada separating gel.

2.7 TEKSTUR