21
3.3.5 Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford, 1976
a. Preparasi pereaksi Bradford
Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 mL etanol 95. Selanjutnya ditambahkan 100 mL asam fosforat 85 dan ditepatkan hingga 1 L menggunakan
akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1, kemudian disimpan dalam botol gelap dan suhu refrigerasi.
b. Pembentukan kurva standar
Sebanyak 100 µL larutan BSA 100-1000 µgmL dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan kemudian
divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ= 595 nm setelah 5 menit. Untuk blanko, sebanyak 100 µL akuades ditambahkan 5 mL perekasi Bradford dan diukur dengan cara yang
sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel. c.
Pengukuran sampel
Sebanyak 100 µL sampel dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan diukur secara
spektrofotometri pada λ= 595 nm setelah 5 menit.
3.3.6 Analisis SDS-
Polyacrylamide Gel Electrophoresis Bollag dan Edelstein, 1991
Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel yang dielektroforesis adalah supernatan protein hasil ekstraksi
protein dari sampel curd kedelai. Tahapan yang harus dilakukan dalam analisis SDS-PAGE adalah 1 pembuatan separating gel; 2 pembuatan stacking gel; 3 preparasi dan injeksi sampel; 4 running
SDS-PAGE; 5 pewarnaan gel; 6 destaining gel; dan 7 penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDS-PAGE dapat dilihat pada
Lampiran 1. a.
Pembuatan separating gel Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai
sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 mL larutan A dipipet ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 2.5 mL larutan B dan 3.5 mL akua-biodestilat. Campuran tersebut
kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µL APS 10 dan 5 µ L TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan
perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan.
Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30 - 60 menit.
b. Pembuatan stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tisu. Akua- biodestilat, larutan A, dan larutan C masing-masing sebanyak 2.3 mL, 0.67 mL, dan 1.0 mL
dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µ L APS 10 dan 5 µ L TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan
diaduk kembali dengan perlahan. Kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah
gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam
22 wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam
dan luar agar gel terendam. c.
Preparasi dan injeksi sampel Sebanyak 40 µL sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µL
buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100
o
C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas
menggunakan akuades setiap kali ingin memasukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7 µL protein marker.
d. Running
SDS-PAGE Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan
dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan,
lalu plat gel dipindahkan dari elektroda. e.
Pewarnaan gel Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi
pewarna coomassie brilliant blue kurang lebih 20 mL. Kemudian digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit.
f. Destaining
gel Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna
ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dan logaritma dari berat molekul marker yang telah
diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur
dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai:
Rf = Jarak migrasi protein
Jarak migrasi tracking dye
3.3.7 Analisis Densitas Pita Protein
Kategori