UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4 Validasi Metode
Gandjar Rohman, 2007; Harmita, 2006; Food Drug and Administration, 2001; United Nations Office on Drug and Crime, 2009
3.4.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas
Ditimbang sebanyak 12,5 mg timokuinon. Dilarutkan ke dalam metanol hingga volume akhir 25 mL sehingga konsentrasi larutan induk 500
μgmL. Kemudian dibuat seri konsentrasi dengan range 0,5
– 500 μgmL sebanyak 0,5 , 10 , 20 , 30 , 50 , 100 , 500
μgmL Hadad et al ., 2012. Lalu larutan standar sebanyak 2
0 μL diinjeksikan ke alat KCKT pada kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi timokuinon dari masing-masing
konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier y = a + bx. Dihitung koefisien korelasi r dari kurva tersebut.
3.4.2 Limit Deteksi LOD dan Limit Kuantitfikasi LOQ
LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linear dari kurva kalibrasi. Dapat dihitung dengan mengukur respon standar beberapa kali lalu dihitung
simpangan baku respon standar dengan formula di bawah ini: LOQ =
�
sedangkan nilai batas deteksi LOD diperoleh dengan rumus : LOD =
,
�
dimana Syx adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan regresi.
3.4.3 Selektivitas
Larutan standar timokuinon konsentrasi 10 μgmL diinjeksikan ke dalam
KCKT sebanyak 20 μL. Kromatogram yang dihasilkan diamati peak timokuinonnya, pada waktu retensi Rt berapa ia muncul. Sampel sebanyak 100
μL dipipet kemudian dilarutkan dalam metanol sampai 10 mL dalam labu ukur, lalu divortex selama 2 menit, didiamkan selama 1 menit, diambil lapisan metanol bagian
atas Enein, et al., 1995. Setelah itu sampel disaring menggunakan syringe filter
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
berukuran 0,45 μm. Kemudian diinjeksikan ke dalam KCKT dengan volume 20 μL.
Kromatogram yang dihasilkan diamati peak timokuinonnya, apakah waktu retensinya sama dengan waktu retensi pada larutan standar.
3.4.4 Akurasi
Untuk uji akurasi dibuat 3 seri larutan dengan menggunakan metoda spiking standar dengan sampel yang sudah diketahui pasti konsentrasinya. Ditimbang
sebanyak 25 mg Timokuinon. Dilarutkan ke dalam metanol hingga volume akhir 25 mL sehingga konsentrasi larutan induk 10
00 μgmL. Seri 1 spiking sampel + standar 80 ppm: dipipet 0,8 ml larutan induk timokuinon dalam labu ukur 10 mL,
lalu ditambahkan 50 μL sampel, dan dilarutkan dengan metanol ad 10 mL.Seri 2
spiking sampel + standar 200 ppm:dipipet 2 mL larutan induk timokuinon dalam labu ukur 10 mL, lalu ditambahkan 50
μL sampel, dan dilarutkan dengan metanol ad 10 mL.Seri 3 spiking sampel + standar 375 ppm: dipipet 3,75 mL larutan induk
timokuinon dalam labu ukur 10 mL, lalu ditambahkan 50 μL sampel, dan dilarutkan
dengan metanol ad 10 mL. Masing-masing seri dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit, didiamkan selama 1 menit, diambil lapisan metanol bagian atas
Enein, et al., 1995. Setelah itu sampel disaring menggunakan syringe filter berukuran 0,45
μm. Kemudian masing-masing seri diinjeksikan ke dalam KCKT
dengan volume injeksi 20 μL. Luas puncak yang didapat disubstitusikan ke dalam
persamaan regresi pada kurva kalibrasi sebagai nilai Y, sehingga didapat konsentrasi dari masing-masing seri. Kemudian dihitung diff dan perolehan
kembalinya.
3.4.5 Presisi
Untuk uji presisi dibuat 3 seri larutan dengan menggunakan metoda spiking standar dengan sampel yang sudah diketahui pasti konsentrasinya. Ditimbang
sebanyak 25 mg timokuinon. Dilarutkan ke dalam metanol hingga volume akhir 25 mL sehingga konsentrasi larutan induk 10
00 μgmL. Seri 1 spiking sampel + standar 80 ppm: dipipet 0,8 ml larutan induk timokuinon dalam labu ukur 10 mL,
lalu ditambahkan 50 μL sampel, dan dilarutkan dengan metanol ad 10 mL. Seri 2
spiking sampel + standar 200 ppm: dipipet 2 mL larutan induk timokuinon dalam
Kategori