UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Pembuatan Larutan Induk Timokuinon
Ditimbang sebanyak 12,5 mg timokuinon. Dilarutkan dalam metanol hingga volume akhir 25 ml. Diperoleh konsentrasi sebesar 500
μgmL. Konsentrasi 500 μgmL digunakan sebagai larutan induk. Dilakukan pengenceran untuk
mendapatkan larutan dengan konsentrasi tertentu.
3.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Analisis Timokuinon
Dibuat spektrum serapan ultraviolet larutan timokuinon dengan konsentrasi 2
μgmL. Dipipet 0,1 mL larutan induk timokuinon dalam labu ukur 25 mL kemudian dilarutkan dalam metanol hingga volume akhir 25 mL. Diukur pada
panjang gelombang 200 – 400 nm menggunakan Spektrofotometer UV-Visibel,
ditentukan panjang gelombang maksimumnya Hadad et al ., 2012.
3.3.3 Penentuan Komposisi Fase Gerak Analisis Timokuinon
Dibuat larutan standar timokuinon pada konsentrasi 50 μgmL. Dipipet 2,5
mL larutan induk timokuinon dalam labu ukur 25 mL kemudian dilarutkan dalam metanol hingga volume akhir 25 mL. D
iinjeksikan sebanyak 20 μL pada komposisi fase gerak metanol : air pada perbandingan 60:40, 65:35, dan 70:30 dengan
kecepatan alir 1,5 mLmenit dan dideteksi pada panjang gelombang terpilih, kemudian dicatat waktu retensi, luas puncak, jumlah plat teoritis, HETP Height
Equivalent Theoritical Plate, asimetrisitas, dan RSD Relative Standard Deviation Gandjar Rohman, 2007.
3.3.4 Uji Kesesuaian Sistem
Larutan standar timokuinon pada konsentrasi 50 μgmL diinjeksikan
sebanyak 20 μL ke alat KCKT dengan fase gerak terpilih, diulangi sebanyak lima
kali. Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, HETP Height Equivalent Theoritical Plate, asimetrisitas, dan RSD Relative Standard Deviation dari waktu retensi
dan luas puncak Gandjar Rohman, 2007.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4 Validasi Metode
Gandjar Rohman, 2007; Harmita, 2006; Food Drug and Administration, 2001; United Nations Office on Drug and Crime, 2009
3.4.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas
Ditimbang sebanyak 12,5 mg timokuinon. Dilarutkan ke dalam metanol hingga volume akhir 25 mL sehingga konsentrasi larutan induk 500
μgmL. Kemudian dibuat seri konsentrasi dengan range 0,5
– 500 μgmL sebanyak 0,5 , 10 , 20 , 30 , 50 , 100 , 500
μgmL Hadad et al ., 2012. Lalu larutan standar sebanyak 2
0 μL diinjeksikan ke alat KCKT pada kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi timokuinon dari masing-masing
konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier y = a + bx. Dihitung koefisien korelasi r dari kurva tersebut.
3.4.2 Limit Deteksi LOD dan Limit Kuantitfikasi LOQ
LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linear dari kurva kalibrasi. Dapat dihitung dengan mengukur respon standar beberapa kali lalu dihitung
simpangan baku respon standar dengan formula di bawah ini: LOQ =
�
sedangkan nilai batas deteksi LOD diperoleh dengan rumus : LOD =
,
�
dimana Syx adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan regresi.
3.4.3 Selektivitas
Larutan standar timokuinon konsentrasi 10 μgmL diinjeksikan ke dalam
KCKT sebanyak 20 μL. Kromatogram yang dihasilkan diamati peak timokuinonnya, pada waktu retensi Rt berapa ia muncul. Sampel sebanyak 100
μL dipipet kemudian dilarutkan dalam metanol sampai 10 mL dalam labu ukur, lalu divortex selama 2 menit, didiamkan selama 1 menit, diambil lapisan metanol bagian
atas Enein, et al., 1995. Setelah itu sampel disaring menggunakan syringe filter