subkutan. Dan efek antiinflamasi ditunjukkan melalui penurunan jumlah sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah subkutan dan penekanan ekspresi
siklooksigenase-2 pada daerah subkutan. Pengujian efek antiinflamasi yang digunakan dalam penelitian ini mengunakan metode uji pengecatan hematoksilin
dan eosin HE dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 pada jaringan subkutan kulit punggung mencit secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam
setelah diinduksi dengan karagenin 3. Hasil pengecatan diamati di bawah mikroskop binokuler Olympus® untuk setiap lima bidang pandang berbeda
dengan perbesaran 400 kali.
E. Metode Pengecatan Hematoksilin dan Eosin HE
Pengujian dengan metode pengecatan hematoksilin dan eosin HE bertujuan untuk memberikan gambaran kemampuan ekstrak etanol daun majapait
dalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan. Hematoksilin dan eosin merupakan
teknik pewarnaan yang berdasarkan pada prinsip asam basa. Sifat basa pada larutan hematoksilin akan memungkinkan hematoksilin berikatan terutama
dengan komponen sel yang bersifat asam. Kita dapat mengamati bahwa warna biru yang ditimbulkan hematoksilin akan banyak ditemukan pada nukleus. Hal ini
terjadi karena nukleus mengandung DNA dan RNA, suatu zat yang bersifat asam. Sementara itu, eosin akan mengikat komponen sel yang bersifat asam.
Kita dapat menemukan cukup banyak komponen sel yang bersifat asidofilik seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen pada sitoplasma sel IHC
World, 2015.
Metode ini diawali dengan membedah kulit punggung mencit setelah diinjeksi dengan karagenin 3 serta pemberian perlakuan pada pengamatan
selama 24 jam. Bagian kulit yang diambil diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10. Pengawetan bertujuan untuk mengawetkan morfologi
sel dan jaringan sesuai dengan kondisi pada saat hewan uji masih dalam keadaan hidup. Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung
direct counting dengan mikroskop binokuler Olympus® untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali.
Sel neutrofil merupakan sel darah putih pertama yang bermigrasi dari pembuluh ke daerah cedera yang dijumpai pada waktu tingkat akut atau fase awal
inflamasi. Sel neutrofil ditarik ke daerah inflamasi oleh faktok kemotaktik, yang dihasilkan oleh bakteri, produk perombakan jaringan, faktor komplemen aktif dan
faktor lainnya
Tambayong, 2000.
Neutrofil disebut
juga sebagai
polimorfonuklear PMN, karena intinya memiliki berbagai jenis bentuk dan bersegmen. Neutrofil matang atau dewasa yang berada dalam peredaran darah
perifer memiliki bentuk inti yang terdiri dari dua sampai lima segmen, sedangkan neutrofil yang belum matang neutrofil band akan memiliki bentuk inti seperti
ladam kuda Schmeltzer and Norsworthy, 2012. Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama, kemudian digantikan oleh
monosit setelah 24 jam sampai 48 jam Kumar, dkk., 2005. Profil pengecatan hematoksilin dan eosin HE antar kelompok perlakuan beserta kontrol dapat
dilihat pada gambar 7 dan tabel I.
Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5 beserta kontrol negatif
karagenin dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit tanda
lingkaran merah
Keterangan : 1. Kulit normal dengan perbesaran 100
kali 2. Kulit normal dengan perbesaran 400
kali 3. Kulit kontrol negatif karagenin
dengan perbesaran 100 kali 4. Kulit kontrol negatif karagenin
dengan perbesaran 400 kali 5. Kulit ekstrak etanol daun majapait
2,5 dengan perbesaran 100 kali 6. Kulit ekstrak etanol daun majapait
2,5 dengan perbesaran 400 kali
Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan Kelompok
Perlakuan Perlakuan
Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE
I Kontrol negatif
111,36 ± 6,98 II
Kontrol Biocream® 109,32 ± 13,26
III Kontrol positif
67,68 ± 7,50 IV
Ekstrak etanol daun majapait 1,67
31,20 ± 1,56 V
Ekstrak etanol daun majapait 2,5
26,36 ± 1,71 VI
Ekstrak etanol daun majapait 3,75
16,76 ± 3,11
Berdasarkan tabel I, menunjukan bahwa pada kelompok kontrol negatif injeksi karagenin 3 dan kelompok Biocream® basis menghasilkan rerata
jumlah sel neutrofil yang paling besar dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainya yaitu 111,36 ± 6,98dan 109,32 ± 13,26. Hal tersebut menunjukan bahwa
karagenin menyebabkan inflamasi. Inflamasi yang diinduksi oleh karagenin dapat digunakan sebagai model peradangan akut. Pada peneliti
an ini digunakan tipe - karagenin yang merupakan polisakarida sulfat yang dapat menginduksi respon
inflamasi dengan mengaktifkan respon imun. Adapun migrasi sel neutrofil merupakan respon dari inflamasi akut Wade, 2014.
Penurunan migrasi sel neutrofil paling besar ditunjukan pada kelompok perlakuan ekstrak etanol 3,75 dengan rerata jumlah sel neutrofil sebesar 16,76 ±
3,11. Diikuti kelompok perlakuan ekstrak etanol 2,5, kelompok perlakuan ekstrak etanol 1,67, dan kelompok kontrol positif dengan rerata jumlah sel
neutrofil sebesar 26,36 ± 1,71; 31,20 ± 1,56; dan 67,68 ± 7,50. Hasil ini menunjukkan bahwa kelompok kontrol positif dan masing-masing kelompok
ekstrak etanol daun majapait memiliki efek antiinflamasi yang dibuktikan dari penurunan migrasi sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah subkutan
dibandingkan dengan kontor negatif karagenin 3 dan kontrol Biocream®. Profil rerata jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam
setelah injeksi karagenin 3 dapat dilihat pada gambar 8.
Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun majapait masing-masing perlakuan dan kontrol
Profil kurva kontrol negatif dan kontrol Biocream® memiliki migrasi jumlah neutrofil pada daerah subkutan paling besar dibanding dengan kelompok
lainnya. Hal ini menunjukan bahwa karagenin merupakan zat inflamatogen yang dibuktikan dengan peningkatan jumlah sel neutrofil di daerah subkutan. Dan basis
yang digunakan untuk ekstrak etanol daun majapait tidak memiliki efek dalam
menurunkan migrasi sel neutrofil yang ditunjukan dari profil garis kurvanya hampir mirip dengan garis kurva kontrol negatif.
Kontrol positif pada penelitian ini mengunakan Hidrokortison asetat 2,5. Hidrokortison merupakan antiinflamasi steroid yang secara dramatis
menurunkan manifetasi dari inflamasi. Kortikosteroid menghambat aktivitas fosfolipase A
2
, yang mengurangi pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian, kortikosteroid akan menghambat pembentukan prostaglandin, tromboksan dan
leukotrien Tjay, 2007. Efek dari antiinflamasi kortikosteroid juga mempengaruhi berbagai sel imuno kompeten seperti sel T, makrofag, sel dendritik, eosinofil,
neutrofil, dan sel mast, dengan cara menghambat respon inflamasi Sitompul, 2011.
Hasil perhitungan jumlah neutrofil antar kelompok dianalisis menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk menentukan kenormalan data yang diperoleh. Uji Shapiro-
Wilk menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p setiap kelompok lebih besar dari p=0,05. Namun hasil uji varian menunjukan nilai p=0,01 p0,05
sehingga diambil kesimpulan bahwa varian data tidak sama. Syarat melakukan uji Anova apabila distribusi data harus normal dan varian data harus sama Dahlan,
2009. Pada penelitian ini, karena distribusi data normal dan varian data tidak sama sehingga uji Anova tidak dapat dilakukan.
Menurut Harinaldi 2005 apabila syarat-syarat yang dibutuhkan oleh metode statistika parametrik tidak dapat dipenuhi, maka peneliti dapat
menggunakan metode alternatif sebagai pengganti analisis varian satu arah One way ANOVA yaitu Kruskal-Wallis Test. Hasil statistik uji Kruskal-Wallis
memberikan nilai p=0,000 0,05 yang berarti paling tidak terdapat satu kelompok yang berbeda secara signifikan dengan taraf kepercayaan 95.
Kemudian dilanjutkan uji Mann Whitney untuk melihat perbedaan bermakna atau tidak antar tiap kelompok perlakuan. Hasil uji Mann Whitney setiap kelompok
perlakuan dapat dilihat pada tabel II.
Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney
Kelompok Rerata Sel
Neutrofil ± SE I
II III
IV V
VI I
111,36 ± 6,98 TB
BB BB
BB BB
II 109,32 ± 13,26
TB BB
BB BB
BB III
67,68 ± 7,50 BB
BB BB
BB BB
IV 31,20 ± 1,56
BB BB
BB BB
BB V
26,36 ± 1,71 BB
BB BB
BB TB
VI 16,76 ± 3,11
BB BB
BB BB
TB
Keterangan: I : Kelompok perlakuan kontrol negatif karagenin 3
II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan basis Biocream® III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan positif hidrokortison 2,5
IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 2,5
VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 3,75 SE : Standar eror
BB: Berbeda bermakna p0,05 TB : Berbeda tidak bermakna p0,05
Berdasarkan tabel II, menunjukan rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3 berbeda tidak bermakna dengan rerata sel neutrofil kelompok Biocream®.
Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki efek antiinflamasi. Rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3 berbeda bermakna
dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3 pada
penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang menginduksi mediator inflamasi.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol
positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif.
Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi
kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 lebih besar dibandingkan kontrol positif.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 juga memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol
positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal
ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok
ekstrak etanol daun majapait 2,5 lebih besar dibandingkan kontrol positif. Hasil rerata sel neutrofil kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75
juga lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 berbeda
bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 memiliki efek
antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 lebih besar dibandingkan kontrol positif.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait
2,5, namun menunjukan perbedaan tidak bermakna secara statistik p0,05. Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol daun majapait 3,75 memiliki efek
antiinflamasi yang sebanding dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 menunjukan perbedaan
yang bermakna dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67. Hal ini berarti bahwa efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait 3, 75 lebih besar
dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan dengan kelompok ekstrak etanol daun
majapait 1,67 dan secara statistik p0,05 berbeda bermakna. Rerata sel neutrofil ekstrak etanol daun majapait 2,5 lebih besar dibandingkan dengan
kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75, namun secara statistik p0,05 berbeda tidak bermakna. Oleh karena itu konsentrasi optimum dari ekstrak etanol
daun majapait yang memiliki efek antiinflamsi topikal terhadap mencit galur Swiss yaitu sebesar 2,5. Pada ekstrak etanol daun majapait 2,5 sudah
menujukkan efek antiinflamasi yang disebabkan oleh karagenin 3 dan efek antiinflamasi yang diberikan sudah lebih baik dari perlakuan ekstrak daun
majapait konsentrasi 1,67 serta efek antiinflamasinya sebanding dengan ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 3,75.
F. Metode Imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2
