F. Metode Imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2
Pengujian dengan metode immunohistokimia dengan antibodi anti- COX-2 bertujuan untuk mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak etanol
daun majapait melalui pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Prinsip dari metode ini adalah adanya pengikatan antigen pada antibodi yang yang dilekatkan dengan
suatu penanda yang bereaksi dengan kromogen DAB Diaminobenzidin sehingga menjadi substrat berwarna cokelat. Pemeriksaan ekspresi COX-2 ekstrak etanol
daun majapait dilakukan dengan melakukan pengecatan mengunakan antibodi
monoklonal primer COX-2.
Antibodi ini berikatan dengan reseptor COX-2 yang ada di sel radang sehingga sel yang mengekspresikan COX-2 berwarna coklat ketika diberi
pewarna DAB dari reagen imunohiostokimia. Visiulisasi warna yang dihasilkan dari ekspresi COX-2 dapat memberikan gambaran kualitatif maupun gambaran
kuantitatif IHC, 2015. Pewarnaan secara enzimatis oleh peroksidase menyebabkan adanya warna yang berbeda antara sel yang mengekspresikan COX-
2 dan sel yang tidak mengekspresikan COX-2. Sel yang mengekspresikan COX-2 akan berwarna kecokelatan yang pekat atau gelap panah warna hitam dan sel
yang tidak mengekspresikan COX-2 akan berwarna keunguan panah warna kuning Gambar 9.
Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 pada sel neutrofil tanda lingkaran merah di daerah subkutan
jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali a dan 400 kali b. Tanda panah hitam
menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2.
Protein siklooksigenase cyclooxygenase = COX menghidrolisis asam arakidonat AA menjadi prostaglandin dengan kedua bentuk isoformnya, yaitu
COX-1 dan COX-2. COX-1 hampir pada semua jaringan, terutama pada saluran cerna dan ginjal, yang mempertahankan fungsi fisiologi normal jaringan Akmal,
dkk., 2007. COX-2 tidak terdeteksi dalam semua sel dan jaringan normal, akan tetapi COX-2 akan cepat terinduksi apabila sel menerima stimulus inflamasi
Widiastuti, 2011. Migrasi sel darah putih leukosit pada daerah cedera jaringan atau infeksi merupakan respon imun tubuh yamg menjadi karakteristik utama
pada inflamasi akut adalah migrasi leukosit terutama neutrofil. Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama sehingga
ekspresi COX-2 pada penelitian ini diekspresikan oleh sel neutrofil. Hasil pengecatan immunohistokimia dengan antibodi anti COX-2 masing-masing
perlakuan beserta kontrol dapat dilihat pada gambar 10 dan tabel III.
Gambar 10. Mikrofotografi pengecatan
Immunohistokimia dengan
antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5 beserta kontrol negatif
karagenin dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit
tanda lingkaran merah
Keterangan :
1. Kulit normal dengan perbesaran 100 kali
2. Kulit normal dengan perbesaran 400 kali
3. Kulit kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 100 kali
4. Kulit kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 400 kali
5. Kulit ekstrak etanol daun majapait 2,5 dengan perbesaran 100 kali
6. Kulit ekstrak etanol daun majapait 2,5 dengan perbesaran 400 kali
Tabel III. Rerata ekspresi protein COX-2 dalam oleh ekstrak etanol daun majapait dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi
karagenin 3
Kelompok Rerata ekspresi protein COX-2 dalam ± SE
I 98,55 ± 0,37
II 97,98 ± 0,22
III 23,40 ± 0,89
IV 91,67 ± 0,41
V 86,56 ± 1,09
VI 85,87 ± 1,18
Keterangan: I : Kelompok perlakuan kontrol negatif karagenin 3
II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan basis Biocream® III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan positif hidrokortison 2,5
IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 2,5
VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 3,75
Data pada tabel III menunjukan bahwa kelompok perlakuan kontrol negatif karagemim 3 dan kontrol Biocream® memiliki rerata persen ekspresi
protein COX-2 paling besar dibanding dengan kelompok lainnya yaitu 98,55 ± 0,37 dan 97,98 ± 0,22. Hal tersebut menunjukan terjadi proses peradangan
dengan adanya injeksi karagenin pada daerah subkutan yang ditandai dengan peningkatan persen ekspresi protein COX-2, serta basis yang digunakan untuk
ekstrak etanol daun majapait tidak memiliki efek dalam menurunkan ekspresi protein COX-2.
Penurunan rerata persen ekspresi protein COX-2 paling besar ditunjukan pada kelompok kontrol positif dengan rerata persen ekspresi protein COX-2
sebesar 23,40 ± 0,89. Diikuti kelompok perlakuan ekstrak etanol 3,75, kelompok perlakuan ekstrak etanol 2,5, dan kelompok perlakuan ekstrak etanol
1,67, dengan rerata persen ekspresi protein COX-2 sebesar 85,87 ± 1,18; 86,56
± 1,09; dan 91,67 ± 0,41. Profil rerata ekspresi protein COX-2 pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3 dapat dilihat pada
gambar 11.
Gambar 11. Diagram batang ekspresi protein COX-2 masing-masing kelompok perlakuan beserta kontrol
Berdasarkan gambar 11 diatas, memperlihatkan terjadi peningkatan jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 setelah pemberian injeksi
subkutan karagenin pada semua kelompok perlakuan. Jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 paling tinggi ditunjukkan oleh kelompok kontrol
negatif karagenin 3 dan kelompok kontrol Biocream®. Protein COX-2 merupakan protein yang bertanggung jawab terhadap respon inflamasi dan
produksi prostaglandin Leahy et al., 2000. Hal ini menunjukkan bahwa
kelompok perlakuan karagenin 3 menginduksi inflamasi sel pada daerah subkutan. Profil kelompok kontrol positif Hidrokortison dan ketiga kelompok
konsentrasi ekstrak etanol daun majapait menunjukkan jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 lebih kecil dibandingkan dengan kelompok
kontrol negatif dan kelompok kontrol Biocream®. Penurunan ekpresi protein COX-2 menunjukan bahwa kontol positif dan kelompok perlakuan memberikan
aktivitas antiinflamasi. Hidrokortison memiliki aktivitas antiinflamasi melalui banyak mekanisme molekuler. Salah satunya melalui jalur reseptor glukokortikoid
yang langsung mengatur ekspresi gen. Dalam mekanisme ini, hidrokortison bebas akan mengikat dan mengaktifkan reseptor glukokortikoid sitosol tertentu GR.
Kompleks tersebut secara selektif menekan gen inflamasi tertentu yang mengkodekan sitokin misalnya IL-1, IL-6, IL-8, TNF-
α, kemokin, molekul adhesi misalnya molekul adhesi E-selektin, ICAM-1, VCAM-1, protein
inflamasi misalnya fosfolipase A2, COX-2, iNOS, mediator lipid inflamasi misalnya prostaglandin Derendorf Meltzer, 2008;. Fernandes et al, 2008.
Hasil perhitungan persen ekspresi protein COX-2 dari masing-masing kelompok perlakuan digunakan untuk menentukan persen penekanan inflamasi
untuk setiap perlakuan. Pengujian distribusi data rata-rata persen penekanan ekpresi protein COX-2 setiap kelompok perlakuan mengunakan uji Shapiro-Wilk
menunjukan distribusi data normal p0,05, sehingga dilanjutkan dengan uji homogenitas variasi. Data yang diperoleh memiliki variasi data yang tidak
homogen dengan nilai p=0,023 p0,05 sehingga uji One Way ANOVA tidak dapat digunakan. Uji Kruskal-Wallis merupakan metode alternatif sebagai
penganti analisis varian satu arah One way ANOVA apabila syarat-syarat yang dibutuhkan oleh metode statistika parametrik tidak dapat dipenuhi. Hasil statistik
uji Kruskal-Wallis memberikan nilai p=0,000 0,05 sehingga diambil kesimpulan paling tidak terdapat satu kelompok yang berbeda yang kemudian
dilanjutkan uji Mann Whitney. Hasil uji Mann Whitney setiap kelompok
perlakuan dapat dilihat pada tabel IV. Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi protein COX-2 dalam masing-
masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney
Kelompok Rerata penekanan
ekspresi protein COX-2 dalam±SE
I II
III IV
V VI
I 1,45 ± 0,37
TB BB
BB BB
BB II
2,02 ± 0,22 TB
BB BB
BB BB
III 76,60 ± 0,88
BB BB
BB BB
BB IV
8,33 ± 0,41 BB
BB BB
BB BB
V 13, 44 ± 1,09
BB BB
BB BB
TB VI
14,13 ± 1,18 BB
BB BB
BB TB
Keterangan: I : Kelompok perlakuan kontrol negatif karagenin 3
II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan basis Biocream® III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan positif hidrokortison 2,5
IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 2,5
VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 dan ekstrak etanol daun majapait 3,75 SE : Standar eror
BB: Berbeda bermakna p0,05 TB : Berbeda tidak bermakna p0,05
Dari tabel IV menunjukan rerata persen penekanan ekspresi protein
COX-2 kelompok karagenin 3 berbeda tidak bermakna dengan kelompok
Biocream®. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki
efek antiinflamasi. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 karagenin
3 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok
konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3 pada penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang
menginduksi mediator inflamasi, sedangkan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun majapait memiliki efek antiinflamasi.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 memiliki rerata persen
penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok
kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini
menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi
protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67 yang lebih kecil
dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67
lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 juga memiliki rerata persen
penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok
kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini
menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi
protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 yang lebih kecil
dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini
menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif.
Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak
etanol daun majapait 3,75 juga lebih besar dibandingkan kelompok kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait
3,75 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 memiliki efek antiinflamasi
dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2
kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 yang lebih kecil dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini menunjukan efek
antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 memiliki rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok
ekstrak etanol daun majapait 1,67 dan 2,5, namun menunjukan perbedaan tidak bermakna secara statistik p0,05 terhadap kelompok ekstrak etanol daun
majapait 2,5. Hal ini berarti bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75 memiliki efek antiinflamasi yang sebanding dengan kelompok ekstrak
etanol daun majapait 2,5. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3, 75 menunjukan perbedaan yang bermakna dengan kelompok ekstrak etanol daun
majapait 1,67. Hal ini berarti bahwa efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun 3, 75 lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait
konsentrasi 1,67.
Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 memiliki rerata persen penekanan lebih besar dibandingkan kelompok ekspresi protein COX-2 daun
majapait 1,67. Hal ini menunjukan bahwa efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun 2,5 lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun
majapait konsentrasi 1,67. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5 lebih kecil dibandingkan dengan
kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75, namun secara statistik p0,05 berbeda tidak bermakna. Oleh karena itu konsentrasi optimun dari ekstrak etanol
daun majapait yang memiliki efek antiinflamsi topikal terhadap mencit galur Swiss yaitu sebesar 2,5 karena sudah menujukan efek antiinflamasi yang
disebabkan oleh karagenin 3 dan sebanding dengan ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 3,75.
G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait
Kategori