Ekspresi MnP, LiP dan Lakase Pleurotus EB6, P. chrysosporium PC dan P. ostreatus HO

0,466 Uml. Pada kondisi tersebut, Pleurotus EB6 mencapai aktivitas LiP tertinggi pada hari ke- ke-2 0,394 Uml Gambar 5.4. Ekspresi lakase pada P. chrysosporium PC tidak terdeteksi. P. ostreatus HO mempunyai ekspresi lakase tertinggi pada hari ke-9 0,817 Uml. Pada kondisi tersebut, Pleurotus EB6 mencapai aktivitas lakase tertinggi pada hari ke- ke-7 0,273 Uml Gambar 5.4. Ekspresi MnP, LiP dan Lakase Serta Bobot Kering Miselium P. djamor EB9 dan Pleurotus EA4 Dalam Produksi Skala Kecil Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 dilihat tingkat ekspresi enzim dan hubungannya dengan bobot kering miselium. Dalam pelaksanaan pengujian terdapat catatan yang diduga dapat mempengaruhi ekspresi enzim yaitu lama penyimpanan enzim kasar serta suhu tempat penyimpanan Tabel 5.6. Oleh karena itu, maka perbandingan aktivitas enzim dan bobot kering miseliumnya yang dapat dilakukan adalah: 1 Ekspresi MnP Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 pada hari ke-3-30; 2 Ekspresi LiP Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 pada hari ke-3-30; 3 Ekspresi lakase Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 pada hari ke-3-30 dan; 4 Ekspresi lakase, MnP dan LiP Pleurotus EB9 pada Pleurotus EA4 pada hari ke-18-30. Tabel 5.6. Lama penyimpanan enzim kasar dari mulai panen sampai analisis ekspresi enzim Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 Lama penyimpanan untuk lakase hari Lama penyimpanan untuk MnP hari Lama penyimpanan untuk LiP hari Hari ke- Pleurotus EB9 -60 o C Pleurotus EA4 -60 o C Pleurotus EB9 -60 o C Pleurotus EA4 -60 o C Pleurotus EB9 -60 o C Pleurotus EA4 -60 o C 3 26 26 47 47 34 34 6 23 23 43 43 31 31 9 20 20 41 41 28 28 12 17 17 40 40 25 25 15 14 14 37 37 22 22 18 49 49 49 49 49 49 21 46 46 46 46 46 46 24 43 43 43 43 43 43 27 40 40 40 40 40 40 30 37 37 37 37 37 37 Produksi enzim isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 diamati setiap 3 hari sekali selama 30 hari. Ekspresi MnP, LiP dan lakase pada hasil penelitian ini tampak berfluktuasi. Isolat Pleurotus EB9 menghasilkan ekspresi MnP tertinggi pada hari ke-9 0,145 Uml. Isolat Pleurotus EA4 menghasilkan ekspresi MnP tertinggi pada hari ke-18 0,310 Uml. Gambar 5.5 Tingkat ekspresi MnP A, LiP B dan lakase C, serta bobot kering miselium D Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 . -0.200 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Lama Inkubasi Hari Ak ti v it a s Lak as e U m l Pleurotus EB9 Pleurotus EA4 C -0.050 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Lama Inkubasi Hari A k tiv ita s M n P U m l Pleurotus EB9 Pleurotus EA4 A -0.100 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Lama Inkubasi Hari A kt ivi ta s L iP U m l Pleurotus EB9 Pleurotus EA4 B 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 5 10 15 20 25 30 35 Lama Inkubasi Hari B o b o t K e ri n g g ra m Pleurotus EB9 Pleurotus EA4 D Isolat Pleurotus EB9 menghasilkan ekspresi LiP tertinggi pada hari ke-24 0,430 Uml. Isolat Pleurotus EA4 menghasilkan ekspresi LiP tertinggi pada hari ke-15 0,609 Uml. Isolat Pleurotus EB9 menghasilkan ekspresi lakase tertinggi pada hari ke-6 0,970 Uml. Isolat Pleurotus EA4 menghasilkan ekspresi lakase tertinggi pada hari ke-27 0,616 Uml Gambar 5.5. Data pengukuran bobot kering miseliumnya menunjukkan bahwa bobot kering Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 cenderung semakin menurun seiring lamanya masa inkubasi. Bobot kering Pleurotus EB9 paling tinggi terlihat pada hari ke-3 dan Pleurotus EA4 pada hari ke-9 Gambar 5.5. Tingkat ekspresi MnP, LiP dan lakase isolat yang tinggi ternyata tidak terjadi pada bobot kering miselium yang tinggi, tapi sebaliknya, terjadi pada bobot kering yang lebih rendah. Namun pada Pleurotus EB9 ekspresi enzim MnP dan LiP puncak terjadi pada bobot kering miselium yang tinggi, yaitu pada hari ke 15 dan Pleurotus EA4 pada panen hari ke 24 Gambar 5.5. Isolasi MnP Dengan Kolom Kromatografi Cair

1. Tahap Pemurnian Dengan Presipitasi 40 Ammonium Sulfat

Purifikasi parsial hanya dilakukan pada Pleurotus EB9 penghasil MnP tertinggi dengan menggunakan media cair 1000 ml dan substrat lignin alami berupa serbuk kayu sengon. Aktivitas enzim ekstraseluler diukur dari filtrat menunjukkan bahwa Pleurotus EB9 mempunyai ekspresi MnP yang semakin meningkat dengan semakin bertambahnya masa inkubasi. Produksi skala besar Pleurotus EB9 yang sudah diberi amonium sulfat 40 menghasilkan aktivitas MnP dan lakase yang signifikan, tapi produksi LiP tidak terdeteksi. Produksi enzim pada Pleurotus EB9 yang telah dipekatkan dengan 40 amonium sulfat Pleurotus EA4-AS diperoleh peak pada fraksi ke 96 Tabel 5.7. Produksi enzim skala besar dengan bioreaktor juga dilakukan terhadap Pleurotus EA4, tujuannya selain untuk pembanding juga untuk melihat adanya potensi produksi MnP. Produksi skala besar isolat Pleurotus EA4 yang sudah diberi amonium sulfat 40 menghasilkan aktivitas LiP dan lakase, namun MnP tidak terdeteksi Tabel 5.7. Tabel 5.7 Ekspresi MnP, LiP dan lakase Uml Pleurotus EB9 dengan substrat kayu sengon dengan kondisi media digoyang dalam bioreaktor dengan Pleurotus EB9-AS, Pleurotus EB9-F dan isolat Pleurotus EA4-AS Lama Inkubasi Mn-P Li-p Lakase H0 0,041 0,224 H1 0,05 0,0701 0,623 H2 0,048 0 0,891 H3 0,083 0 0,694 H4 0,117 0 0,926 H5 0,124 0,06 0,836 H6 0,213 0 0,97 EB9-AS 0,138 0,914 EB9-F 0,062 0 EA4-AS 0 0,179 0,086 Keterangan: EB9-AS: Produksi enzim Pleurotus EB9 yang sudah diberi 40 amonium sulfat; EB9-F: Produksi enzim pada Pleurotus EB9-AS diperoleh peak pada fraksi ke 96 yang kemudian diambil; EA4-AS: Produksi skala besar isolat Pleurotus EA4 yang sudah diberi amonium sulfat 40

2. Tahap Pemurnian Dengan Kolom Kromatografi Cair

Penelitian isolasi MnP isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 dimulai dengan kromatografi kolom dan SDS-PAGE fraksi hasil kromatografi kolom tersebut. Untuk isolat Pleurotus EA4 menggunakan kromatografi kolom terbuka penukar ion dengan matriks DEAE dan matriks Phenyl, sedang untuk Pleurotus EB9 menggunakan kromatografi kolom terbuka penukar ion dengan matriks DEAE. Hasil ekstraksi dan purifikasi enzim kasar Pleurotus EA4, pada perlakuan inkubasi 4 hari maupun 12 hari tidak diperoleh pita-pita yang menunjukkan keberadaan MnP atau enzim, walaupun sudah ditambahkan amonium sulfat 40. Hal ini menunjukkan bahwa isolat Pleurotus EA4 tidak menghasilkan MnP, sehingga tidak dilakukan eksperimen lebih lanjut Gambar 5.6. Isolasi enzim MnP Pleurotus EB9 yang difermentasi 6 hari tanpa diberi amonium sulfat tidak menghasilkan enzim karena diduga konsentrasinya kurang pekat. Setelah diberi amonium sulfat 40, diperoleh beberapa fraksi enzim dari mulai enzim kasar sampai hasil elusi 0,1, 0,2, 0,3 dan 0,4 NaCl dan pita dengan bobot molekul kira-kira 43 kDa yang merupakan bobot molekul rata-rata MnP Gambar 5.7.