Tahap Pemurnian Dengan Kolom Kromatografi Cair
Keterangan: Pada sampel pemekatan 40 amonium sulfat sebelum kromatografi, diperoleh aktivitas UmL: MnP, 0; LiP, 0,179; lakase, 0,086.
Buffer pp+AS: buffer pirofosfat dan ammonium sulfat; M: marker LMW
Gambar 5.6 SDS-PAGE hasil kromatografi kolom gel hidrofobik Phenyl- Sepharose
terhadap sampel pemekatan 40 amonium sulfat isolat Pleurotus
EA4.
Keterangan: Pada sampel pemekatan 40 AS sebelum kromatografi, diperoleh aktivitas UmL: MnP, 0, 138; LiP, 0; lakase, 0,914; Crude E4 12 h ink: ekstrak kasar Pleurotus EA4
umur kultur 12 hari inkubasi.
Gambar 5.7 SDS-PAGE hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE- Sepharose terhadap sampel pemekatan 40 amonium sulfat isolat
Pleurotus EB9.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Lane : M = LMW
1 = ekstrak AS 60 2 = elusi 0.04 buffer pp+AS
3 = elusi 0.08 buffer pp+AS 4 = elusi 0.12 buffer pp+AS
5 = elusi 0.16 buffer pp+AS 6 = elusi 0.20 buffer pp+AS
7 = elusi 0.24 buffer pp+AS 8 = elusi 0.28 buffer pp+AS
9 = elusi 0.32 buffer pp+AS 10= elusi 0.36 buffer pp+AS
11= elusi 0.40 buffer pp+AS 12= ekstrak kasar
14,4 20,1
30,0 45,0
66,0 97,0
kDa
Gambar 5.8 Kromatogram pemurnian protein sampel Pleurotus EB9-amonium
sulfat 40 dengan gel kromatografi. Ekstrak kasar Pleurotus EB9 yang sudah diberi amonum sulfat kemudian
disentrifugasi. Endapan yang diperoleh dilarutkan dengan buffer pirofosfat pH 7 sebanyak 10 ml dan didialisis dengan buffer yang sama sebanyak 2 liter selama 17
jam. Hasil pemurnian protein menunjukkan bahwa aktivitas MnP muncul pada fraksi ke 96 Gambar 5.8. Purifikasi parsial MnP dilakukan dengan mengelusi
endapan yang telah dilarutkan ke dalam kolom kromatografi gel HiPrep 1660 Sephacryl S-200 resolusi tinggi GE Biosciences menggunakan buffer 10 mM
potassium fosfat pH 7,0, dengan kecepatan alir 0,3 mLmenit dan fraksinasi 1,5 mLfraksi pada HPLC AKTA Purifier GE Biosciences.
Pada Gambar 5.9 disajikan fraksi 96 kromatografi gel isolat Pleurotus EB9 yang kemudian dilakukan SDS-PAGE dan hasilnya terdapat pita yang sangat jelas
dengan bobot molekul sekitar 41,7 sampai dengan 43 kDa yang diperkirakan bobot molekul MnP.
Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9 filtrat enzim kasar sebesar 1,092 Umg, sedangkan aktivitas spesifik enzim MnP untuk Pleurotus EB9 40
amonium sulfat presipitas 40 AS sebesar 1,605 Umg. Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9-Fraksi 96 kromatografi gel diperoleh sebesar 4,133 Umg
protein. Kemungkinan tingkat kemurnian total akan jauh lebih besar, karena hanya 1 ml yang diambil untuk HPLC dari 40 ml contoh Tabel 5.8.
Keterangan: M: marker; 1: lajur 1, yaitu sampel awal sebelum kromatografi gel; 2: lajur 2, fraksi
96
Gambar 5.9 SDS-PAGE hasil kromatografi kolom gel terhadap sampel pemekatan 40 amonium sulfat dari Pleurotus EB9.
Hasil tahapan purifikasi disajikan pada Tabel 5.8, terlihat bahwa persen perolehan kembali recovery MnP yang didapat sebesar 4,133 Umg protein
dengan kemurnian 3,8 kali. Tingkat keberhasilan pemurnian yield ini masih sangat rendah, sehingga di kemudian hari masih perlu diperbaiki tahap pemurnian
yang lebih efektif.
Tabel 5.8 Aktivitas enzim MnP dari Pleurotus EB9 pada tahapan pemurnian parsial
Konsentrasi Protein Aktivitas MnP
No. Sampel
Volume Sampel
ml mgml Mg
per volume
total Uml
Unit per volume
total Umg
Tingkat Kemurnian
x Yield
1 Filtrat kasar
550 0,195 107,25 0,213 117,15 1,092 1,0
100 2 Presipitas
40 AS 40 0,086 3,44 0,138 5,52 1,605 1,5
4,7 3
Fraksi 96 kromatografi
gel 1 0,015 0,015 0,062 0,06 4,133 3,8 0,05
Pembahasan
Hasil uji pendahuluan dalam percobaan untuk melihat ekspresi enzim ligninolitik jamur kelompok Pleurotus tersebut, menunjukkan bahwa isolat
Pleurotus EA4, Pleurotus EB6, Pleurotus EAB7, Pleurotus EB24 dan P.
ostreatus HO tidak menghasilkan MnP dengan jumlah signifikan. Sementara
Pleurotus EB9 paling tinggi menghasilkan MnP dalam substrat serbuk gergajian
kayu sengon. Penelitian yang sama dilakukan pada ketujuh isolat dengan penentuan
aktivitas ligninolitik MnP ekstrak. Isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4, diketahui memiliki kemampuan dalam proses delignifikasi material lignoselulosa
yaitu substrat kayu sengon. Produksi skala besar untuk isolasi MnP dengan memakai isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 dilakukan dengan
menggunakan substrat kayu sengon dan menggunakan bioreaktor. Sesuai dengan hipotesis yang disampaikan, bahwa isolat spesies jamur yang berbeda memiliki
aktivitas ligninase yang berbeda. Ternyata bahwa jenis isolat dan juga media berpengaruh dalam produktivitas enzim ligninolitik. Dalam penelitian ini media
yang digunakan adalah media yang mengandung mangan yang dimodifikasi dari Brown et al. 1990, yaitu dengan penambahan serbuk kayu sengon sebanyak 8
graml. Penambahan sumber lignin alami diharapkan dapat meningkatkan aktivitas enzim. Karena sumber lignin alami serbuk kayu sengon ini juga dapat
memperbaiki pertumbuhan jamur liar yang diuji. Aktivitas MnP, LiP dan lakase pada produksi skala kecil oleh jamur
kelompok Pleurotus dalam penelitian tampak berfluktuasi, hasil ini diduga disebabkan ketidakstabilan enzim ekstraseluler atau adanya kebocoran pada sel
jamur, sesuai dengan pendapat Kerem et al. 1992. Hasil penelitian ini diduga juga disebabkan kurangnya ulangan hanya 2 ulangan dan dilakukan dalam botol,
yang harus dibuka ketika tiap kali dilakukan pengambilan ekstrak kasar dengan cara mengambil langsung menggunakan mikropipet. Disarankan pada penelitian
yang akan datang, kultur dilakukan di dalam bioreaktor yang memudahkan dalam pengambilan ekstrak kasar tanpa harus mengganggu pertumbuhan jamur.
Produksi enzim skala besar pada isolat Pleurotus EB9 menghasilkan MnP dan lakase yang signifikan, sementara produksi LiP tidak terlalu signifikan.
Aktivitas MnP mulai muncul pada hari ke-3 inkubasi, dan semakin meningkat seiring masa inkubasi sampai hari ke enam. Demikian juga aktivitas lakase, yang
mulai muncul sejak satu hari inkubasi, walaupun tampak adanya fluktuasi. Pada hari keenam, enzim kasar tersebut dipanen. Selama kultur masal 1 liter dalam
bioreaktor selama 6 hari, pH menurun perlahan dari 5,6-4,8. Pada panen hari ke-6 diperoleh pH optimum sebesar 4,8. Penurunan pH secara perlahan sebesar lebih
kurang 0,8 selama 6 hari inkubasi menunjukkan pertumbuhan miselium yang optimum, yang menunjukkan respirasi berjalan normal. Gangguan seperti
kurangnya aerasi pada kultivasi ini dapat mengakibatkan penurunan pH secara drastis menjadi 2,8 pada hari ke 6.
Perbandingan antara Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 hasil produksi yang sudah diberi amonium sulfat untuk memekatkan kadar enzimnya, diketahui
bahwa Pleurotus EB9 menghasilkan MnP sebesar 0,138 Uml dan aktivitas LiP tidak terdeteksi dan lakase sebesar 0,914 Uml sedangkan pada isolat Pleurotus
EA4 aktivitas MnP tidak terdeteksi dan produksi LiP dan lakase, berturut-turut adalah 0,179 dan 0,086 UmL. Menurut Sarkar et al. 1997, manganese
peroksidase pada media glucose-amonium tartrate atau glukose-peptone, muncul pada hari ke 3 dan maksimal pada hari ke 6, kemudian akan menurun. Deteksi
dilakukan dengan heme absorban pada λ 410 nm, sedang pada P. chrysosporium
maksimal pada hari ke 5 dengan λ 415 nm, dan pada P. radiata dapat dideteksi
pada λ 610 nm. Jenis isolat dan media berpengaruh pada produktivitas enzim
ligninolitik. Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9 filtrat enzim kasar sebesar
1,092 Umg, sedangkan aktivitas spesifik enzim MnP untuk Pleurotus EB9 dengan presipitas 40 amonium sulfat sebesar 1,605 Umg. Aktivitas spesifik
MnP untuk Pleurotus EB9-Fraksi 96 kromatografi gel yang diperoleh sebesar 4,133 Umg protein dengan kemurnian 3,8 kali. Hasil rangkuman data pemurnian
MnP dari Pleurotus EB9, menunjukkan tingkat keberhasilan pemurnian yield yang masih sangat rendah, sehingga dikemudian hari masih perlu diperbaiki tahap
pemurnian yang lebih efektif. Dalam percobaannya, Sarkar et al. 1997
melaporkan bahwa medium pepton meningkatkan hasil MnP pada P. ostreatus sampai 65 dan faktor purifikasi 25. Pada P. eryngii, P. ostreatus, P.
pulmonarius dan P. sajor-caju, MnP tidak terdeteksi bila ditumbuhkan dalam
media cair dengan ammonium tartrate sebagai sumber N, aktivitas tinggi MnP diperoleh pada medium pepton mendekati 3 Uml pada kultur P. eryngii.
Fraksi 96 kromatografi gel isolat Pleurotus EB9 yang kemudian dilakukan SDS-PAGE dan hasilnya terdapat pita yang sangat jelas dengan bobot molekul
sekitar 41,7 sampai dengan 43 kDa yang diperkirakan bobot molekul MnP. Hasil ini diyakini bahwa isolat Pleurotus EB9 menghasilkan MnP yang telah berhasil
dimurnikan dan menunjukkan bobot molekul 43 kDa. Ligninolitik berhubungan dengan produksi enzim ekstraseluler
pendegradasi lignin yang dihasilkan oleh jamur pelapuk putih. Dua enzim yang berperan dalam proses tersebut adalah lakase, LiP dan MnP Howard et al. 2003;
Kirk et al. 1978. Lakase merupakan enzim multi-copper yang dapat mengkatalis reaksi
oksidasi beberapa substrat seperti polifenol, substituen penol, diamin dan beberapa senyawa anorganik Thurston 1994. Mekanisme reaksi enzimatik yang
terjadi oleh lakase adalah reaksi oksidasi satu elektron. Dibutuhkan peranan molekul oksigen sebagai penerima elektron dan kemudian membentuk molekul
air. Ketika reaksi oksidasi berlangsung, substrat kehilangan satu elektronnya dan biasanya terbentuk radikal fenoksi bebas Thurston 1994 yang berperan sebagai
intermediet. Radikal bebas yang tidak stabil tersebut dapat melangsungkan reaksi oksidatif enzimatik selanjutnya atau reaksi non-enzimatik seperti hidrasi,
disproporsionasi dan polimerisasi Thurston 1994. Lakase telah banyak menjadi subyek penelitian untuk dimanfaatkan secara
luas oleh karena lakase sifat spesifiknya yang rendah terhadap substrat- substratnya Cavallazzi et al. 2004; Thurston 1994. Pemanfaatan lakase sangat
luas diterapkan dalam berbagai bidang antara lain dalam proses bioremediasi dan biodegradasi polutan organik pada tanah seperti klorofenol Ahn et al. 2002, dan
polisiklik aromatik hidrokarbon Han et al. 2004, pada proses dekolorisasi dan detoksifikasi pada pewarna tekstil Abadulla et al. 2000 serta digunakan sebagai
bleaching pada proses biodelignifikasi pada pulp industri kertas Bourbonnais dan
Paice 1992. Lignin peroksidase EC.1.11.1.14; diarilpropan: oksigen, hidrogen
peroksida oksidoreduktase; bobot molekul antara 38 dan 43 kDa dan MnP EC.1.11.1.13; MnII: H
2
O
2
oksidoreduktase; bobot molekul antara 43 dan 49 kDa merupakan glikoprotein yang memiliki sebuah protoporfirin IX sebagai
gugus prostetik dan membutuhkan hidrogen peroksida sebagai oksidan Hatakka 1994; Tien dan Kirk 1984; Gold dan Alic 1993.
Enzim ekstraseluler LiP dan MnP memiliki peranan yang sangat penting dalam proses biodelignifikasi. LiP memiliki kemampuan mengkatalis beberapa
reaksi oksidasi antara lain pemecahan ikatan C α-Cβ rantai samping propil non
fenolik komponen aromatik lignin, oksidasi benzil alkohol, oksidasi fenol, hidroksilasi benzylic methylene groups dan pemecahan cincin aromatik komponen
non phenolik senyawa lignin Tien dan Kirk 1984. Sedangkan MnP diketahui memiliki kemampuan mengoksidasi baik komponen fenolik maupun non fenolik
senyawa lignin. Seperti enzim peroksidase lainnya, LiP memiliki siklus katalitik yang
dinamakan mekanisme ping-pong. Reaksi yang terjadi yakni H
2
O
2
mengoksidasi enzim pada keadaan awal resting enzyme dengan dua elektron membentuk
senyawa intermediet I, senyawa tersebut kemudian mengoksidasi substrat aromatik dengan menggunakan satu elektron membentuk senyawa intermediet II
dan produk radikal bebas. Senyawa intermediet II yang dihasilkan dapat kembali mengoksidasi substrat lainnya sehingga terbentuk enzim awal dan produk radikal
bebas Cullen dan Kersten 1992. Terbentuknya radikal bebas secara spontan atau bertahap inilah yang mengakibatkan lepasnya ikatan antar molekul dan beberapa
inti pada cincin aromatik. Prinsip fungsi MnP adalah bahwa enzim tersebut mengoksidasi Mn
2+
membentuk Mn
3+
dengan adanya H
2
O
2
sebagai oksidan. Aktivitasnya dirangsang oleh adanya asam organik yang berfungsi sebagai pengkelat atau penstabilkan
Mn
3+
. Mekanisme reaksi yakni MnP pada keadaan awal dioksidasi oleh H
2
O
2
membentuk MnP-senyawa I yang dapat direduksi oleh Mn
2+
dan senyawa fenol membentuk MnP-senyawa II. Senyawa tersebut kemudian direduksi kembali oleh
Mn
2+
tetapi tidak oleh fenol membentuk enzim keadaan awal dan produk Wariishi et al. 1989. Adanya Mn
2+
bebas sangat penting untuk menghasilkan siklus katalitik yang sempurna.
Manganese peroksidase dihasilkan oleh P. ostreatus Sarkar et al. 1997 dan juga oleh P. crysosporium Brown et al. 1990 dan oleh Phlebia radiata
Vares et al. 1995. Masing-masing jamur menghasilkan kombinasi enzim yang berbeda-beda, misalnya ada yang hanya menghasilkan LiP dan MnP, MnP dan
lakase, atau jamur yang menghasilkan LiP dan lakase Kerem dan Hadar 1998. Sampai saat ini isolat jamur pelapuk putih P. chrysosporium banyak menjadi
obyek para peneliti dikarenakan menghasilkan aktivitas LiP dan MnP yang tinggi. Seperti halnya pada lakase selain potensi dalam proses biodelignifikasi, lignin
peroksidase dan mangan peroksidase berpotensi dalam proses biobleaching dan biopulping
pulp serta proses degradasi senyawa-senyawa berbahaya. Terdapat dua tipe jamur pelapuk putih yaitu : a yang menghasilkan LiP,
MnP dan lakase dan 2 tanpa LiP Hatakka 1994. LiP dan MnP secara umum telah dikarakterisasi pada P. chrysosporium, dan produksi lakase telah dilaporkan
pada jamur ini dengan media dengan selulosa sebagai sumber karbon Srinivasan et. al
. 1995. Umumnya jamur pelapuk putih, termasuk P. eryngii dan P. ostreatus
, termasuk grup kedua. Ketidakadaan LiP pada tipe kedua ini menyebabkan degradasi lignin lebih condong dalam jerami gandum Martinez et
al. 1994 dalam Sarkar et al. 1997. Menurut Peláez et al. 1995 tipe ini
menghasilkan juga aril alkohol oksidase AAO. Meskipun tanpa LiP, spesies tersebut mampu mendegradasi lignin jerami gandum Martinez et. al. 1996, yang
merupakan sifat penting untuk aplikasi bioteknologi yang berhubungan dengan industri pulp dan kertas dan makanan hewan. Spesies ini juga menghasilkan aryl-
alcohol oxidase AAO Peláez et. al. 1995 sebuah enzim yg berpartisifasi dalam
produksi hidrogen peroksida yang penting untuk aksi MnP Guillén et.al. 1996. Studi-studi saat ini menunjukkan pengaruh positif Mn2+ pada degradasi lignin
oleh Pleurotus Camarero et. al. 1996. Pleurotus
spp. diketahui mempunyai daya delignifikasi yang selektif dibanding P. chrysosporium yang delignifikasinya tidak selektif Kerem et al.
1992. Hal ini merupakan potensi yang besar untuk industri pulp, khususnya dalam proses biobleaching dan biopulping Jurasek dan Paice 1990.
Aktivitas ligninolitik jamur pelapuk putih seperti pada Trametes versicolor dan P. chrysosporium meningkat pada media tumbuh yang kandungan karbon
sederhana dan nitrogennya rendah Eaton dan Hale 1993; Katagiri et al. 1995. Namun berdasarkan hasil penelitian Sugipriatini 1998 diketahui bahwa
penambahan glukosa dapat menekan pertumbuhan maupun aktivitas ligninolitik salah satu jamur pelapuk putih Ganoderma spp.. Beberapa jamur liar diketahui
memiliki kemampuan mendegradasi lignin yang tinggi dan dalam pertumbuhannya menggunakan lignin sebagai sumber karbon Artiningsih et al.
2000. Ho et al. 1990 juga mengemukakan bahwa penambahan 0,25 pulp pada media inokulum mendorong kecepatan pertumbuhan C. versicolor dengan
memperpendek periode lag bleaching dari 2 hari menjadi 1 hari dan mempertinggi proses rangkaian pemutihan pulp.
Karakterisasi ligninolitik isolat-isolat jamur uji pada substrat gergajian kayu sengon menunjukkan bahwa Pleurotus EB9, Pleurotus EA4 dan Pleurotus
EAB7 mempunyai potensi ligninolitik. Namun dalam aktivitas enzim Pleurotus EB9 lebih menonjol dibanding isolat lainnya. Perbedaan potensi isolat Pleurotus
dalam biodegradasi diduga karena kondisi kultur yang berbeda yaitu antara media padat dan cair juga diduga dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Pada media
padat, enzim yang disekresikan lebih terkonsentrasi atau mengumpul karena mempunyai kerapatan atau densitas molekulnya yang tinggi. Pada media cair,
enzim yang terinduksi akan mudah menyebar dan molekul enzimnya akan bereaksi dengan substrat yang berada cukup jauh karena disebarkan oleh air.
Selain itu dengan menggunakan media cair, maka dapat dilakukan pengadukan, sehingga proses degradasi substrat lebih merata dan sempurna. Kultivasi media
yang padat akan mempersulit pengadukan. Menurut laporan Ho et al. 1990 dan Reid et al. 1990 pengadukan secara mekanik dengan kecepatan 110-220 putaran
per menit telah dapat mencegah penggumpalan dan proses pemutihan biologis berjalan sempurna. Menurut Herliyana 1997 proses pemutihan pulp kayu akasia
dan pulp kayu pinus dengan menggunakan P. chrysosporium pada kondisi aerasi maupun non-aerasi menghasillkan perubahan warna pulp yang masih belum
merata, yaitu terlihat masih adanya warna gelap pada sebagian pulp pinus. Selain faktor aerasi dan tidak adanya pengadukan, ukuran gumpalan pulp juga diduga
menjadi salah satu faktor penyebab belum meratanya degradasi lignin pada pulp. Degradasi lignin, prinsipnya merupakan proses oksidatif dan tidak-spesifik
oleh jamur pelapuk putih. Proses tersebut berhubungan dengan lignin peroxidase dan sistem kompleks dengan beberapa enzim ligninolytic, H2O2-producing and
reductases dan reduced oxygen species Kirk dan Farrell 1987; Hatakka 1994;
Guillén et. al. 1996. Enzim-enzim ligninolitik, LiP, MnP dan lakase, mengkatalisis oksidasi satu elektron unit lignin aromatic radicals yang memulai
depolimerisasi non-enzymatic. Jamur yang menghasilkan MnP ini adalah P. ostreatus
Sarkar et al. 1997, P. chrysosporium Brown et al. 1990 dan Phlebia radiata
Vares et al. 1995. Enzim ini akan menghasilkan produk berupa Mn
3+
dan air, reaksinya adalah MnSO
4
+ H
2
O
2
↔ Mn
3+
+ H
2
O. Terdapat tiga MnP yang berbeda telah dipurifikasi dari P. ostreatus dan
satu MnP isoenzyme telah dipetakan Becker dan Sinitsyn 1993; Asada et. al. 1995. MnP isoenzymes pada P. eryngii menunjukkan sifat katalitik yang telah
dikarakterisasi dari media glukosa pepton Martinez et. al. 1996. Sifat biokimia dan molekuler MnP isoenzymes yang dihasilkan P. eryngii
dan P. ostreatus dalam media glucose-peptone telah dianalisis. Dua DNA probes untuk P. eryngii dan P. ostreatus diperoleh dengan PCR untuk mendeteksi
homologi diantara gen-gen MnP pada kedua jamur tersebut Sarkar et. al. 1997.
Simpulan
Isolat dengan MnP yang signifikan yaitu Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 kemudian dipurifikasi MnP-nya. Berdasarkan hasil yang telah didapatkan,
bahwa produk enzim ligninolitik dipengaruhi oleh kondisi media, jenis isolat, dan suhu serta lama penyimpanan. Isolat Pleurotus EB9 menunjukkan ekspresi lakase
dan MnP yang signifikan pada media cair, namun untuk LiP tidak terdeteksi. Sebaliknya isolat Pleurotus EA4 menunjukkan ekspresi lakase dan LiP yang
signifikan, namun untuk MnP tidak terdeteksi.
Isolasi enzim dengan kolom kromatografi cair dari Pleurotus EA4 tidak didapatkan pita-pita yang menunjukkan keberadaan MnP. Hal ini menunjukkan
bahwa Pleurotus EA4 tidak menghasilkan enzim MnP. SDS-PAGE hasil kromatografi kolom penukar ion DEAE-Sepharose
terhadap sampel pemekatan 40 amonium sulfat dari Pleurotus EB9 diperoleh pita dengan bobot molekul kira-kira 43 kDa, yang merupakan BM rata-rata MnP.
Selanjutnya hasil pemurnian dengan kolom gel kromatografi HiPrep 1660 Sephacryl
S-200 resolusi tinggi diperoleh peak pada fraksi ke 96. SDS PAGE hasil kromatografi kolom gel terhadap sampel pemekatan 40 amonium sulfat
dari Pleurotus EB9 diyakini bahwa Pleurotus EB9 menghasilkan MnP. Data pemurnian MnP dari Pleurotus EB9 menunjukkan bahwa tingkat
pemurnian masih sangat rendah 3,8. Aktivitas spesifik MnP yang diperoleh sekitar 4,133 Umg protein.