labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 g iodin dan 2 g kalium iodida lalu
dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi dragendorff dibuat dengan cara
0,8 g bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam
20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini
berwarna jingga.
2 Steroidtriterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian ke dalamnya ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan
3 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.
3 Flavonoid
Sejumlah sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume yang sama
dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
4 Saponin
Saponin dapat dideteksi denan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan
adanya saponin.
5 Fenol hidrokuinon pereaksi FeCl
3
Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan
FeCl
3
5. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.
6 Tanin
Sejumlah sampel kemudian ditambahkan pereaksi FeCl3. Terbentuknya warna merah tua menunjukkan terdapat komponen tanin di dalam bahan.
3.3.7 Uji aktivitas antioksidan dengan Metode DPPH Salazar-Aranda et al.
2009
Ekstrak kasar lamun dari hasil ekstraksi tunggal menggunakan pelarut metanol polar, etil asetat semipolar dan n-heksana nonpolar dilarutkan dalam
etanol dengan konsentrasi yang berbeda. Pelarut metanol dan etil asetat dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi 31,25; 62,5; 125; 250 dan 500 ppm. Pelarut
n-heksana dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi 600, 700,750, 800, 850 dan 900 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol
positif. BHT dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut etanol dengan konsentrasi 0,24; 0,48; 0,97; 1,95; 3,90; 7,81 dan 15,625 ppm. Larutan DPPH
yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut etanol dengan konsentrasi 1 mM.
Uji aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan kemampuan sampel yang digunakan dalam mereduksi radikal bebas stabil DPPH. 1 mg ekstrak kasar dan
BHT sebagai kontrol positif ditimbang lalu ditambahkan etanol dengan perbandingan 1:1000. Selanjutnya 1,3 mg DPPH diencerkan dengan 25 ml etanol.
1 µl etanol diisikan ke dalam microwell plate yang telah disiapkan. Setelah itu, dilakukan pengisian ekstrak dengan beberapa konsentrasi dan penambahan larutan
DPPH. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Serapan yang dihasilkan diukur dengan elisa reader pada panjang
gelombang 517 nm. Persentase penghambatan aktivitas radikal bebas diperoleh dari nilai
absorbansi sampel. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi sampel dan presentase pengahambatan aktivitas radikal bebas. Nilai konsentrasi
penghambatan aktivitas radikal bebas sebanyak 50 IC
50
dihitung dengan menggunakan persamaan regresi. Nilai IC
50
diperoleh dengan memasukkan Y=50 serta nilai A dan B yang telah diketahui. Nilai x sebagai IC
50
dapat dihitung dengan persamaan :
y = A + B Lnx Keterangan :
y = persen inhibisi A = slope
B = intercept x = konsentrasi sampel mgl
3.4 Rancangan percobaan dan Analisis Data
Perlakuan pada penelitian ini adalah penggunaan jenis pelarut yaitu polar metanol, semipolar etil asetat dan nonpolar n-heksana. Semua perlakuan
dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Hipotesis rancangan acak lengkap RAL terhadap rendemen, total fenol dan aktivitas antioksidan ekstrak adalah sebagai
berikut: H0 : jenis pelarut tidak berpengaruh nyata terhadap nilai rendemen, total fenol
dan aktivitas antioksidan αi = 0 H1 : jenis pelarut berpengaruh nyata terhadap nilai rendemen, total fenol dan
aktivitas antioksidan α ≠ 0 Model rancangan yang digunakan untuk menganalisis data rendemen hasil
ekstrak, total fenol dan aktivitas antioksidan adalah rancangan acak lengkap RAL dengan model sebagai berikut :
Y
ij
= μ + α
i
+ ε
ij
Keterangan : Y
ij
= hasil pengamatan rendemen ekstrak, uji total fenol, aktivitas antioksidan dan jenis pelarut i pada ulangan ke-j
µ = rataan umum
α
i
= pengaruh jenis pelarut ε
ij
= sisaan akibat jenis pelarut taraf ke-i pada ulangan ke-j Analisis ragam digunakan untuk menganalisis data. Uji lanjut Duncan
digunakan jika analisis ragam menunjukkan hasil berbeda nyata.
Keterangan : Sy
= Significant range KTS = kuadran tengah sisa
r = ulangan
qa’ = significant studentized range
Rp = wilayah nyata terkecil dari nilai rata-rata
