59
Disain primer SNAP dilakukan menggunakan WebSNAPER, masing-masing posisi SNP dapat diperoleh sejumlah alternatif pasangan primer untuk
menghasilkan marka SNAP. Pemilihan pasangan primer yang digunakan harus memperhatikan hal-hal seperti suhu annealing pasangan primer yang tidak terlalu
jauh, ujung 3’ primer yang tidak memiliki self-annealing, dimmer dan hairpin. Primer yang terpilih untuk dijadikan marka SNAP disajikan pada Tabel 5.4.
5.3.5 Evaluasi Primer SNAP untuk Menghasilkan Marka
Primer SNAP yang telah berhasil dikembangkan perlu diuji untuk menghasilkan marka SNAP. Optimasi suhu annealing enam pasangan primer
SNAP dilakukan secara gradien pada mesin PCR dengan suhu 48
O
C sampai 60
O
C. Hasil optimasi primer didapatkan suhu yang optimal yaitu 50
O
C dan hanya lima pasang primer SNAP yang mampu menghasilkan produk PCR sesuai dengan
harapan 200 –334 pb, sedangkan satu pasang primer SNAP Vs_SNP_27 Ref
dan Alt tidak mampu menghasilkan produk PCR sesuai dengan ukuran target. Hasil visualisasi primer SNAP Vs_SNP_27 pada gel agarose menghasilkan
produk dengan ukuran lebih kecil dari 100 pb. Hal ini diduga disebabkan oleh kemampuan penempelan primer pada templet DNA yang tidak sempurna.
Berdasarkan posisi SNP primer ini, terdapat 26 nukleotida yang dijadikan sekuen primer namun pada posisi ini terdapat banyak variasi SNP. Hal inilah yang
menyebabkan proses desain primer Vs_SNP_27 mengalami kegagalan.
Berdasarkan pengujian lima pasang primer SNAP pada 80 sampel kacang bogor, didapatkan hasil yang positif untuk empat pasang primer SNAP baik untuk
alel referensi maupun untuk alel alternatif Gambar 5.7. Namun, satu pasang primer dengan kode Vs_SNP_502 hanya menghasilkan produk PCR untuk alel
Tabel 5.4 P
rimer SNAP terpilih dari 6 posisi SNP berdasarkan fragmen gen Pto asal kacang bogor
No. Primer Id Sequence
Tm Size
1 Vs_SNP_27_REF
GGGTGTTGGTAATGTTTATCAG 51.5
286 2
Vs_SNP_27_REVERSE TGCATATCTCAAGCCTTTGC
53.5 3
Vs_SNP_27_ALT GGGTGTTGGTAATGTTTAGAAT
50.8 4
Vs_SNP_78_REF CAATTAAACGTGGGAATCGA
50.7 293
5 Vs_SNP_78_REVERSE
ACGGTGGATGATAGTGTGT 53.2
6 Vs_SNP_78_ALT
GCAATTAAACGTGGGAATCTT 51.5
7 Vs_SNP_378_REF
TGGCCACCCACTTCTCTTCA 58.7
249 8
Vs_SNP_378_REVERSE CCTTGTTTCTCTGATTGGATAC
51.0 9
Vs_SNP_378_ALT GCCACCCACTTCTCCTCC
58.0 10
Vs_SNP_481_REF GAAGTATTCTGGATCCAGGTA
50.9 200
11 Vs_SNP_481_REVERSE
CTGCTAGGGGTTTACACTATC 52.2
12 Vs_SNP_481_ALT
GAAGTATTCTGGATCCAGGTC 52.2
13 Vs_SNP_502_REF
TTGTCAGTTAGTTGCTGCCTCTT 56.7
334 14
Vs_SNP_502_REVERSE TCCTTGTTTATGATTATATGGGCT
51.9 15
Vs_SNP_502_ALT GTCAGTTAGTTGTTGCCTCAA
53.0 16
Vs_SNP_510_REF TCAGATTTGTCAGTTAGGTGC
52.6 332
17 Vs_SNP_510_REVERSE
ATGATTATATGGGCTATGGAAC 49.8
18 Vs_SNP_510_ALT
GTCAGATTTGTCAGTTAGGTGT 52.5
60 referensi saja Gambar 5.8. Dari hasil elektroforesis, skoring individu [++]
menunjukkan bahwa genotipe kacang bogor yang dianalisis dengan empat lokus SNP mempunyai kombinasi alel yang heterozigot, dan satu lokus SNP
mempunyai kombinasi alel yang homozigot.
Hasil ini dibuktikan dengan analisis lanjutan pada progeni tanaman kacang bogor. Sebanyak 47 progeni yang diuji dengan empat lokus primer SNAP juga
didapatkan hasil skoring [++] untuk kedua alelnya referensi dan alternatif dan skoring [+-] untuk lokus Vs_SNP_502 Tabel 5.5. Perbandingan pola segregasi
alel pada progeni adalah 1:1. Berdasarkan hasil ini dapat disimpulkan bahwa individu-individu yang dianalisis memiliki kombinasi alel gen Pto yang
homozigot pada dua lokus untuk masing-masing alel. Sehingga saat diamplifikasi dengan primer referen maupun primer alternet akan menghasilkan produk PCR.
SNP_78 SNP_378 SNP_481 SNP_510
R A R A R A R A
Gambar 5.7 Visualisasi produk PCR hasil amplifikasi genom kacang bogor menggunakan empat pasang primer SNAP pada gel agarose 1. R =
alel referensi, A = alel alternetif.
SNP_481 SNP_502
R A R A R A M R A R A R A
Gambar 5.8 Visualisasi produk PCR hasil amplifikasi genom kacang bogor menggunakan 2 pasang primer SNAP pada gel agarose 1. M =
Marker 100 pb, R = alel referensi, A = alel alternetif.
Tabel 5.5 Data genotipe hasil konversi dari elektroferogram produk PCR menggunakan primer SNAP berbasis gen Pto kacang bogor
Aksesi SNP_78
SNP_378 SNP_481
SNP_502 SNP_510
R A
R A
R A
R A
R A
SKC6 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
0 1 1 0
1 0 SKC14
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 0 1
1 0 1 0
SKH3 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
0 1 1 0
1 0 SKH33
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 0 1
1 0 1 0
SMP1 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
0 1 1 0
1 0 SMP32
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 0 1
1 0 1 0
SMH3 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
0 1 1 0
1 0 SMH12
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 0 1
1 0 1 0
OGN9 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
0 1 1 0
1 0 0GN4
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 1 0
1 0 0 1
1 0 1 0
