51
5.1 Pendahuluan
Kacang bogor atau Bambara groundnut Vigna subterranea L. Verdc. merupakan tanaman legume yang sangat berpotensi untuk dikembangkan karena
tanaman ini mengandung karbohidrat, protein dan lemak yang tinggi Brough et al. 1993. Selanjutnya, Mkandawire 2007 menyatakan bahwa, tanaman kacang
bogor mampu tumbuh dengan baik pada daerah marginal dan lebih adaptif dari tanaman legume lainnya. Studi keragaman genetik kacang bogor menggunakan
marka molekuler masih terbatas. Beberapa marka molekuler telah digunakan untuk mempelajari keragaman genetik kacang bogor diantaranya: marka RAPD
Amadou et al. 2001; Massawe et al. 2003, marka AFLP Massawe et al. 2002, marka SSR Basu et al. 2007; Somta et al. 2011; Molosiwa 2012, marka ISSR
Rongnoi et al. 2012, dan Marka DArT Olukolu et al. 2012. Namun, belum ada studi yang mempelajari tentang keragaman genetik kacang bogor terhadap respon
ketahanan terhadap penyakit.
Perkembangan marka molekuler sangat pesat terutama untuk kepentingan studi keragaman, identifikasi dan seleksi suatu karakter. Marka yang berkembang
dewasa ini adalah Single Nucleotide Amplified Polymorphism SNAP. Sampai saat ini, belum ada laporan maupun publikasi tentang penggunaan marka SNAP
pada tanaman kacang bogor terutama berdasarkan ketahanan terhadap serangan penyakit. Pada masa mendatang penelitian yang berbasis SNP akan terus
dikembangkan terutama untuk menghasilkan marka molekuler untuk seleksi terhadap karakter tertentu sesuai dengan posisi dari SNP tersebut. Ketahanan
terhadap penyakit merupakan salah satu karakter penting yang perlu dipelajari lebih lanjut pada tanaman kacang bogor karena tanaman ini lebih toleran dan
tahan terhadap cekaman abiotik maupun abiotik.
Marka molekuler berbasis SNP telah mulai banyak digunakan untuk studi genotipe Till et al. 2010, pembuatan peta tautan genetik beresolusi tinggi Rabbi
et al. 2012, penentuan spesies kerabat jeruk Jiang et al. 2010, dan seleksi untuk karakter tertentu MAS dalam proses pemuliaan tanaman Gupta et al. 2001.
SNP yang terdapat pada gen fungsional coding region mendapat perhatian khusus karena secara langsung berhubungan dengan sifat yang diekspresikan oleh
gen yang bersangkutan, oleh karena itu marka SNP dibuat berdasarkan sekuen dari expresses sequence tags ESTs Shu et al. 2010.
Frekuensi ditemukannya SNP bervariasi tergantung pada tanaman. Pada tanaman jagung ditemukan 1 SNP per 31 pasang basa pb di bagian noncoding
region dan 1 SNP per 124 pb di bagian coding region Ching et al. 2002. Pada kedelai ditemukan 1.64 SNP per 1 kb coding region dan 4.85 SNP per 1 kb non-
coding region Zhu et al. 2003. Keberadaan SNP juga berpotensi ditemukan pada sekuen DNA dari gen Pto. Informasi situs SNP pada gen Pto yang berasal dari
tanaman kacang bogor belum ada, apalagi digunakan untuk studi genetik dan seleksi ketahanan terhadap patogen.
Ketahanan secara kuantitatif pada berbagai tanaman telah banyak dipelajari. Berdasarkan pengamatan fenotipe dijelaskan bahwa sifat resistensi dikendalikan
oleh banyak gen poligenik, oleh karena itu pendekatan yang digunakan untuk mempelajarinya difokuskan pada gen-gen yang berpotensi terlibat dalam lintasan
biokimia ketahanan terhadap penyakit. Hal ini didasarkan pada dugaan bahwa gen-gen tertentu yang dikenal fungsinya berhubungan dengan ketahanan tanaman
52 memegang peranan dalam interaksi antara tanaman dengan patogen Lanaud et al.
2004. Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi fragmen DNA gen Pto dan menganalisis keragaman perubahan basa nukleotida pada sekuen gen Pto
berdasarkan hasil proses perunutan sequencing DNA genom kacang bogor.
5.2 Bahan dan Metode
5.2.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai Maret 2015 sampai dengan Mei 2015 di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, Institut Pertanian Bogor.
5.2.2 Bahan dan Alat
Bahan penelitian yang digunakan adalah sebanyak 78 biji yang terdiri atas 40 biji yang berasal dari daerah Sukabumi 20 biji berwarna coklat dan 20 biji
berwarna hitam dan 38 biji yang berasal dari daerah Sumedang 20 biji berwarna putih dan 18 biji berwarna hitam beserta 47 progeni. Semua sampel dianalisis
secara individu dengan primer SNAP yang dikembangkan berdasarkan sekuen gen Pto yang berasal dari tanaman kacang bogor.
5.2.3 Amplifikasi DNA Genom dan Analisis Sekuen Gene Pto
Delapan individu kacang bogor dengan kode SKC6, SKC14, SKH3, SKH33, SMP1, SMP32, SMH3, dan SMH12 diamplifikasi dengan primer universal atau
degenerate primer untuk gen Pto. Primer tersebut terdiri atas Pto_forward dengan runutan sekuen: GGA GGA TTT GGT AAR GTN TAY AAR dan
Pto_reverse dengan runutan sekuen: ACC ACA CCA AAT GAP TAN ACP TC Kurniasih 2012. Total volume mix PCR adalah 12.
5 μl yang terdiri atas 6.25 μl Master mix KAPPA 2x, 1.0
μl 2.5 μM masing-masing primer primer forward dan reverse
, 2 μl 20 ng DNA genom, dan 2.25 μl ddH
2
O. Proses PCR dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Bio-Rad T100.
Kondisi PCR yang digunakan sebagai berikut: denaturasi awal pada 94 °C selama 2 menit; selanjutnya diulang sebanyak 35 siklus dengan kondisi 94 °C selama 15
detik, 48 °C selama 30 detik, 72 °C selama 1 detik; diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72 °C selama 7 menit. Visualisasi produk hasil amplifikasi PCR
dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 1 menggunakan Buffer SB 1x dan pewarnaan menggunakan gel red GelRed
TM
dengan 100 volt selama 30 menit. Proses perunutan sekuensing fragmen DNA gen Pto dilakukan pada jasa
sekuensing 1st BASE, Malaysia. Hasil sekuensing dianalisis dengan menggunakan software SeqMan
™II DNASTAR. Pembacaan hasil sekuensing dilakukan dengan cara mensejajarkan hasil perunutan basa DNA fragmen gen Pto
antara primer forward dan reverse dalam satu windows, sehingga akan didapatkan sekuen lengkap masing-masing sampel dan akan ditemukan daerah yang over lap
pembacaan data sekuens dari arah forward dan reverse. Data hasil pembacaan runutan sekuen disimpan dalam format teks pada notepad atau microsoft word.
5.2.4 Analisis Runutan Fragmen DNA dan Asam Amino
Analisis runutan fragmen DNA gen Pto dan penentuan runutan asam amino dilakukan dengan software Geneious Basic versi 5.6.6. Hasil perunutan asam
Kategori