Amplifikasi DNA dan Sekuensing Fragmen Gen Pto

60 referensi saja Gambar 5.8. Dari hasil elektroforesis, skoring individu [++] menunjukkan bahwa genotipe kacang bogor yang dianalisis dengan empat lokus SNP mempunyai kombinasi alel yang heterozigot, dan satu lokus SNP mempunyai kombinasi alel yang homozigot. Hasil ini dibuktikan dengan analisis lanjutan pada progeni tanaman kacang bogor. Sebanyak 47 progeni yang diuji dengan empat lokus primer SNAP juga didapatkan hasil skoring [++] untuk kedua alelnya referensi dan alternatif dan skoring [+-] untuk lokus Vs_SNP_502 Tabel 5.5. Perbandingan pola segregasi alel pada progeni adalah 1:1. Berdasarkan hasil ini dapat disimpulkan bahwa individu-individu yang dianalisis memiliki kombinasi alel gen Pto yang homozigot pada dua lokus untuk masing-masing alel. Sehingga saat diamplifikasi dengan primer referen maupun primer alternet akan menghasilkan produk PCR. SNP_78 SNP_378 SNP_481 SNP_510 R A R A R A R A Gambar 5.7 Visualisasi produk PCR hasil amplifikasi genom kacang bogor menggunakan empat pasang primer SNAP pada gel agarose 1. R = alel referensi, A = alel alternetif. SNP_481 SNP_502 R A R A R A M R A R A R A Gambar 5.8 Visualisasi produk PCR hasil amplifikasi genom kacang bogor menggunakan 2 pasang primer SNAP pada gel agarose 1. M = Marker 100 pb, R = alel referensi, A = alel alternetif. Tabel 5.5 Data genotipe hasil konversi dari elektroferogram produk PCR menggunakan primer SNAP berbasis gen Pto kacang bogor Aksesi SNP_78 SNP_378 SNP_481 SNP_502 SNP_510 R A R A R A R A R A SKC6 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SKC14 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SKH3 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SKH33 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SMP1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SMP32 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SMH3 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 SMH12 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 OGN9 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0GN4 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 61 Sehubungan dengan pengembangan marka SNAP untuk marka ketahanan terhadap penyakit, marka molekuler berbasis SNP sebaiknya dikembangkan dari beberapa gen yang mempunyai peranan dalam ketahanan terhadap penyakit. Sebagai contoh implementasi marka SNAP berbasis SNP yang berasal dari gen Pto, dapat digabungkan dengan SNP yang berasal dari gen chitinase dan β-1,3- glucanase Sutanto et al. 2013.

5.4 Kesimpulan

Fragmen gen Pto asal kacang bogor yang berukuran 555 pb, berhasil diidentifikasi adanya 22 posisi SNP, tetapi hanya 6 posisi SNP yang digunakan untuk mendisain primer SNAP. Berdasarkan 6 posisi SNP terpilih, dihasilkan 12 pasang primer SNAP untuk pengembangan marka SNAP kacang bogor. Sebanyak 12 pasang primer yang didapat, 9 pasang primer SNAP terbukti efektif untuk mengamplifikasi DNA genom kacang bogor, sedangkan 3 pasang primer SNAP lainnya tidak berhasil mengamplifikasi DNA genom kacang bogor. Berdasarkan lokus SNP_78, SNP_378, SNP_481 and SNP_510, genotipe kacang bogor mempunyai kombinasi alel yang heterozigot, dan satu lokus SNP_502 mempunyai kombinasi alel yang homozigot. Daftar Pustaka Amadou HI, Bebeli PJ, Kaltsikes PJ. 2001. Genetic diversity in Bambara groundnut Vigna subterranea L. germplasm revealed by RAPD markers. Genome. 446:995-999. Basu S, Roberts JA, Azam-Ali SN, Mayes S. 2007. Bambara groundnut. Di dalam: Kole C, editor. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants. Volume 3: Pulses, Sugar and Tuber Crops. Pennsylvania State University US: Springer Verlag Berlin Heidelberg. hlm 159-173. Brough SH, Taylo, AJ, Azam-Ali SN. 1993. The potential of bambara groundnut Vigna subterranea in vegetable milk production and basic protein functionality systems. Food Chem. 473:277-283. Brueggeman R, Rostoks N, Kudrna D, Kilian A, Han F, Chen J, Druka A, Steffenson B, Kleinhofs A. 2002. The barley stem rust-resistance gene Rpg1 is a novel disease-resistance gene with homology to receptor kinases. Proc Natl Acad Sci USA. 9914:9328-9333. Chang JH, Tai YS, Bernal AJ, Lavelle DT, Staskawicz BJ, Michelmore RW. 2002. Functional analyses of the Pto resistance gene family in tomato and the identification of a minor resistance determinant in a susceptible haplotype. Mol. Plant Microbe Interact. 153:281-291. Chinchilla D, Bauer Z, Regenass M, Boller T, Felix G. 2006. The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception. Plant Cell. 182:465-476. Ching A, Caldwell KS, Jung M, Dolan M, Smith OS, Tingey S, Morgante M, Rafalski AJ. 2002. SNP frequency, haplotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines. BMC Genet. 31:19.