Desain Primer untuk Marka SNAP

63 leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 861:123-133. Shu YJ, Li Y, Wu NLH, Bai X, Cai H, Ji W, Zhu YM. 2010. Mining and identification of SNPs from EST sequences in soybean and converting SNP markers into CAPS. Acta Agron Sin. 364:574-579. Sunyaev S, Ramensky V, Koch I, Lathe W, Kondrashov AS, Bork P. 2001. Prediction of deleterious human alleles. Hum Mol Genet. 106:591-597. Sutanto, A, Hermanto C, Sukma D, Sudarsono. 2013. Pengembangan marka SNAP berbasis resistance gene analogue pada tanaman pisang Musa spp.. J Hort. 234:300-309. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Bio Evo. 3012:2725-2729. Till BJ, Jankowicz-Cieslack J, Sagi L, Huynh AO, Utsushi H, Swennen R, Terauchi R, Mba C. 2010. Discovery of nucleotide polymorphism in the Musa gene pool by Ecotilling. Theor Appl Genet. 1217:1381-1389. Totad AS, Fkhrudin B, Kuruvinashetti MS. 2005. Isolation and characterization of resistnce gene analogue RGAs from sorghum Sorghum bicolor L. Moenih. Euphytica. 1431:179-188. Wu A-J, Andriotis VME, Durrant MC, Rathjen JP. 2004. A patch of surface- exposed residues mediates negative regulation of immune signaling by tomato Pto kinase. Plant Cell. 166:2809-2821. Yuksel B, Estill JC, Schulze SR, Paterson AH. 2005. Organization and evolution of resistance gene analogs in peanut. Mol.Gen. Genomics. 2743:248-263. Zhang N, Wang S, Wang HY, Liu DQ. 2011. Isolation and characterization of NBS-LRR class resistance homologous gene from wheat. J Integra Agric. 108:1151-1158. Zhu YL, Song QJ, Hyten DL, Van-Tassell CP, Matukumalli LK, Grimm DR, Hyatt SM, Fickus EW, Young ND, Cregan PB. 2003. Single nucleotide polymorphisms in soybean. Genetics. 1633:1123-1134. 64 6 PEMBAHASAN UMUM Kacang bogor sangat berpotensi untuk dikembangkan sebagai pangan alternatif di Indonesi. Biji tanaman ini kaya akan protein, karbohidrat dan lemak Ijarotimi dan Esho 2009. Sampai sekarang ini, galur maupun varietas kacang bogor belum ada sehingga peluang untuk perakitan varietas unggul sangat besar. Upaya perakitan varietas unggul tanaman memerlukan keragaman yang tinggi Jain 2011. Peningkatan keragaman genetik dapat dilakukan melalui metode konvensional dan non konvensional. Metode konvensional dapat dilakukan melalui persilangan dan introduksi, sedangkan secara non konvensional dapat dilakukan melalui fusi protoplas, kultur anter, rekayasa genetika dan variasi somaklonal. Variasi somaklonal adalah keragaman genetik yang berasal dari kultur in vitro Larkin dan Scowcroft 1981. Induksi variasi somaklonal melalui embriogenesis somatik memberikan peluang peningkatan keragaman yang tinggi dan tingkat seleksi dapat dilakukan secara dini dengan menggunakan marka molekuler. Penelitian ini terdiri atas tiga percobaan yaitu organogenesis dan embriogenesis somatik kacang bogor, analisis keragaman genetik kacang bogor tanaman in vitro dan in vivo menggunakan marka SSR dan pengembangam marka SNAP berdasarkan sekuens gen Pto. Sistem regenerasi tanaman secara in vitro sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis dan konsentrasi ZPT dalam media Bairu et al. 2011. Penggunaan BAP tunggal menghasilkan respon lebih baik untuk induksi dan proliferasi tunas daripada media kombinasi BAP dengan NAA. Selain komposisi media, jenis eksplan juga sangat besar pengaruhnya terhadap keberhasilan regenarasi tunas secara in vitro Christoper et al. 1996. Penggunaan eksplan axis memberikan interaksi yang baik pada media yang mengandung 1.0 – 2.0 mg L -1 BAP. Media yang optimal untuk induksi akar secar in vitro adalah media kombinasi 2.0 mg L -1 BAP dengan 0.1 mg L -1 NAA. Menurut Gaspar et al. 1996, auksin sangat diperlukan dalam pertumbuhan organogenesis termasuk dalam pembentukan akar. Kombinasi auksin dengan konsentrasi yang tepat dapat meningkatkan inisiasi dan induksi akar pada kultur in vitro. Laporan tentang keberhasilan sistem regenerasi embrio somatik pada kacang Bogor sampai saat ini belum ada. Tersedianya protokol embrio somatik yang stabil merupakan prasyarat untuk melakukan perbaikan genetik tanaman melalui transformasi genetik. Selain itu, perbaikan genetik tanaman dapat dilakukan dengan menginduksi variasi dari jaringan somatik dengan mnggunakan mutagen fisik maupun mutagen kimia. Berbeagai hasil penelitian telah melaporkan bahwa penggunaan ZPT 2,4-D pada konsentrasi yang tinggi dapat menyebabkan variasi somaklonal Gesteira et al. 2002. Protokol embriogenesis somatik pada kacang Bogor perlu diketahui agar somaklon dapat diregenerasikan menjadi tanaman. Pada penelitian ini diperoleh media yang optimal untuk induksi kalus embriogenik yaitu media MSVitB5 dengan penambahan 5 mg L -1 2,4-D dan 3 mg L -1 picloram. Media proliferasi terbaik adalah media MSVitB5 yang mengandung 3 mg L -1 picloram, sedangkan media perkembangan kalus embriogenik menjadi embrio somatik fase globular adalah 0.1 mg L -1 picloram. Percobaan pembentukan embrio somatik sampai pada fase kotiledon belum berhasil dilakukan. 65 Embriogenesis digunakan sebagai salah satu cara untuk meningkatkan keragaman. Penerapkan aspek-aspek bioteknologi dalam kultur in vitro melalui sistem embriogenesis dapat membantu berbagai kendala atau permasalahan dalam pemuliaan konvensional, terutama dalam hal transformasi genetik. Keragaman yang dihasilkan malalui embriogenesis dapat dideteksi secara dini dengan menggunakan marka molekuler. Analisis molekuler telah banyak dilakukan pada berbagai jenis tanaman dalam hal identifikasi tanaman, studi keragaman bahkan ketahanan terhadap penyakit Wang et al. 2012; Yulong et al. 2006. Penelitian menggunakan marka molekuler untuk tanaman kacang Bogor masih perlu dikembangkan lebih lanjut. Analisis keragaman menjadi dasar bagi pemulia tanaman kacang Bogor dalam perakitan varietas unggul dimasa depan. Penerapan marka molekuler akan sangat membantu program pemuliaan dalam hal seleksi terhadap karakter yang diinginkan. Berdasarkan analisis marka SSR dalam penelitian ini, kacang Bogor yang berasal dari Sumedang lebih beragam daripada daerah Sukabumi. Nilai ini memperlihatkan tingkat keragaman yang masih rendah. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Molosiwa 2012 menyatakan bahwa, keragaman genetik kacang Bogor asal Indonesia Bandung dan Gresik relatif rendah H E =0.18 dari pada negara lain. Mutasi adalah salah satu dari proses evolusi Carlin 2011, dengan mengetahui dan mempelajari situs SNP yang merupakan representasi dari mutasi akan dapat ditelusuri proses evolusi suatu gen serta asal dari gen tersebut Lercher 2002. Perubahan basa nukleotida baik secara transversi, transisi, delesi ataupun insersi pada suatu gen dapat disebabkan oleh perubahan lingkungan, paparan bahan kimia atau radiasi yang menyebabkan rusaknya untaian DNA Clancy 2008. Pengembangan marka SNAP berdasarkan delapan sekuens gen Pto yang berasal dari kacang bogor berhasil identifikasi 22 posisi SNP. Sekuens yang dianalisis merupakan coding region sepanjang 555 pb yang menyandikan 185 asam amino. SNP yang ditemukan pada coding region bersifat merubah asam amino non-synonymous, tidak merubah asam amino synonymous Sunyaev et al. 2001. Keberadaan SNP pada sekuens fragmen gen Pto yang dianalsis, 54.5 menyebabkan terjadinya perubahan asam amino hasil translasi non synonimous, sedangkan 45.5 tidak menyebabkan perubahan residu jenis asam amino hasil translasi DNA. Berdasarkan hasil ini, hanya enam posisi SNAP yang dikembangkan menjadi primer SNAP dan menghasilkan 12 pasang primer SNAP. Hasil evaluasi primer SNAP pada kacang bogor, didapatkan sembilan pasang positif menghasilkan produk amplifikasi, sedangkan tiga pasang primer SNAP lainnya gagal. Berdasarkan lokus SNP_78, SNP_378, SNP_481 and SNP_510, genotipe kacang bogor mempunyai kombinasi alel yang heterozigot, dan satu lokus SNP_502 mempunyai kombinasi alel yang homozigot.