Uji genotoksisitas dengan bakteri Seratia marcescens

Setelah diinkubasi 24 jam dilakukan pengamatan secara visual dengan melihat hasil goresan yang terbentuk. Apabila hasil goresan berwarna putih maka ekstrak tersebut bersifat genotoksik, namun apabila tetap terbentuk warna merah sebagaimana warna bakteri S. marcescens maka ekstrak tidak bersifat genotoksik atau aman untuk digunakan sebagai bahan obat. 3.3.6 Fraksinasi dan isolasi senyawa inhibitor topoisomerase I 3.3.6.1 Kromatografi Lapis Tipis KLT Pemisahan senyawa inhibitor topoisomerase I dilakukan dengan kromatografi lapis tipis KLT dengan mencari eluen yang cocok untuk pemisahan komponen aktif dari ekstrak kloroform daun katang-katang. Eluen yang terbaik dalam kromatografi lapis tipis akan digunakan dalam proses kromatografi kolom. Proses awal KLT adalah persiapan lempeng lapis tipis silika gel 60 F 254 dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 2 cm, diberi tanda garis dengan pensil pada jarak 1 cm pada kedua ujung lempeng. Ekstrak katang-katang ditimbang sebanyak 0.02 g dan dilarutkan dalam 0.5 ml pelarut asalnya. Eluen yang akan digunakan dimasukkan ke dalam tabung kromatografi hingga tingginya sekitar 1 cm dari dasar tabung dan ditutup rapat agar jenuh dengan uap eluen. Larutan ekstrak sampel diteteskan dengan pipa kapiler pada lempeng silika gel. Penetesan dilakukan pada jarak 1 cm dari salah satu ujung tersebut. Ujung lempeng yang terdekat pada tempat penetesan dicelupkan ke dalam tabung kromatografi yang sudah jenuh dengan eluen. Tabung kemudian ditutup rapat dan dibiarkan pelarut naik sampai batas yang ditentukan 1 cm dari batas atas Gambar 9. Gambar 9. Teknik kromatografi lapis tipis. Batas atas Batas bawah Setelah elusi pada batas tertentu, lempeng diangkat dan selanjutnya dikering udarakan selama beberapa menit, kemudian dideteksi dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan 365 nm. Pemilihan pelarut eluen pada proses KLT dilakukan dengan kombinasi pelarut yang berbeda yaitu sistem B yang terdiri dari pelarut toluen : etil asetat 7 : 3. Terpilihnya sistem B dengan perbandingan tersebut didasarkan atas penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Agustiningrum 2004. Hasil KLT ekstrak kloroform dengan sistem B diamati dengan sinar UV pada panjang gelombang 365 nm, selanjutnya dihitung nilai Rf dari masing-masing spot yang terbentuk.

3.3.6.2 Kromatografi kolom

Prosedur kerja fraksinasi dengan kromatografi kolom KK adalah sebagai berikut: 1 Kolom dipasang pada statif secara tegak lurus, pada bagian dasar kolom diberi glass wool dan diisi dengan pelarut sampai sepertiganya sebagai eluen. Kemudian dimasukkan silika gel yang telah disuspensikan dengan eluen. Campuran silika gel dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit agar diperoleh lapisan yang seragam Gambar 10. 2 Sebelum ekstrak dimasukkan dalam kolom, ekstrak dilarutkan dengan pelarut asalnya. Eluen yang digunakan pada KLT menjadi acuan untuk menentukan eluen pada kolom namun tidak sesederhana itu harus melalui tata kerja yang agak empiris dengan mengurangi komponen pelarut polar sampai harga Rf lebih kecil dari 0.3 pada KLT Gritter et al. 1991. 3 Ekstrak dimasukkan ke dalam kolom yang telah dijenuhkan kemudian dielusi dengan pelarut terpilih dan harus dihindari adanya gelembung udara dalam kolom. Pada pengelusian pelarut yang dimasukkan ke dalam kolom diawali dengan pelarut non polar baru dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar.