ditambahkan NaOH 10 bv atau H
2
SO
4
pekat. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon
sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H
2
SO
4
pekat menunjukkan adanya flavonoid.
C Saponin
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambah air secukupnya dan dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian
dikocok. Timbulnya busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya
saponin. D Tanin
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambahkan air kemudian didihkan selama beberapa menit, lalu disaring. Filtratnya ditambahkan FeCl
3
bv. Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.
E Triterpenoid dan Steroid
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambahkan 25 ml etanol 30 lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter. Lapisan
eter dipipet dan diujikan pada papan uji dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard 3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H
2
SO
4
pekat. Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau
menunjukkan adanya steroid.
3.3.4 Uji aktivitas inhibitor topoisomerase I TopoGen 2006
Uji inhibitor enzim DNA topoisomerase I dilakukan menggunakan kit Drug
Screening dari TopoGen dengan metode elektroforesis. Substrat yang digunakan adalah DNA supercoil 25
μg dalam 100 μl buffer TE, yang terdiri atas 0.25
μgμl TE 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA sebanyak 1 μl, kemudian ditambah 2
μl enzim DNA topoisomerase I. Volume reaksi akhir menjadi 20
μl. Penambahan dilakukan berurutan, yang terakhir ditambahkan adalah enzim topoisomerase I. Akuades ditambahkan untuk mencapai volume
20 μl. Selain untuk preparasi reaksi untuk sampel juga disertakan dengan reaksi-
reaksi yang berfungsi sebagai kontrol Lampiran 4. Gambar 7 menyajikan diagram alir uji aktivitas inhibitor topoisomerase I.
Gambar 7. Diagram alir uji aktivitas inhibitor topoisomerase I Pereaksi harus dibuat dalam tabung mikrosentrifuse dalam es. Setelah
penambahan enzim, tabung diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit, reaksi dihentikan dengan 110 volume dari 10 SDS. Selanjutnya ditambahkan dengan
proteinase-K atau pronase untuk menghancurkan ikatan protein dan diinkubasi kembali pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Hasil inkubasi diencerkan dengan larutan penyangga kemudian diekstraksi dengan CIA chloroform : isoamyl
alcohol = 24 : 1 dan dilanjutkan sentrifugasi. Lapisan atas dari hasil sentrifugasi
yang berwarna biru dianalisis elektroforesis dengan gel agarosa. Gel agarosa yang telah dielektroforesis selanjutnya diwarnai dengan etidiumbromida.
Kualitatif bentuk DNA nick dan supercoil ditentukan dengan melihat hasil gel agarosa yang telah dielektroforesis di bawah sinar UV. Aktivitas inhibisi
enzim ditentukan dengan kemampuan enzim untuk mengubah bentuk DNA supercoil
menjadi DNA bentuk nick atau relaks untuk topoisomerase I. Enzim DNA topoisomerase I yang digunakan adalah human topoisomerase I dari
Diinkubasi 37
o
C selama 30 menit dalam heating block
Akuades untuk mencapai volume 20 µl 10 x buffer TGS 2 µl
DNA Supercoil 250 ngµl 1 µl Inhibitor atau sampel
Enzim DNA topoisomerase I 2 μl terakhir
Reaksi dihentikan dengan menambahkan 10 SDS 2 µl dan proteinase-K 50 µgml diinkubasi pada 37
o
C selama 30 menit Hasil inkubasi diencerkan dengan loading buffer dan
ditambahkan volume yang sama dengan 20 µl CIA chloroform : isoamyl alcohol 24:1
Divorteks dan diputar dalam microfuge secukupnya
Lapisan teratas diambil berwarna biru, lalu dielektroforesis dengan gel agarose 1 dan pewarnaan dengan ethidium bromide
TopoGen. Sebagai kontrol positif digunakan kamptotekin pada konsentrasi 100 µM 34.84 µgml.
3.3.5 Uji genotoksisitas dengan bakteri Seratia marcescens
