Uji genotoksisitas dengan bakteri Seratia marcescens Identifikasi fraksi hasil kromatografi kolom dengan analisis GCMS

TopoGen. Sebagai kontrol positif digunakan kamptotekin pada konsentrasi 100 µM 34.84 µgml.

3.3.5 Uji genotoksisitas dengan bakteri Seratia marcescens

Tahap awal melakukan uji genotoksisitas adalah proses penyegaran bakteri S. marcescens dalam agar miring. Media yang digunakan adalah pepton, beef extract , NaCl, bacto agar, dan akuades pH 7 Lampiran 5, sedangkan untuk pengujian genotoksisitasnya menggunakan cawan petri. Perlakuan yang digunakan adalah kontrol tanpa ekstrak dan ekstrak berturut-turut dengan konsentrasi 20, 200, 2 000, 20 000, 30 000, 40 000, dan 50 000 µgml. Proses pengujian genotoksisitas dimulai dengan persiapan media steril bervolume 15 ml. Setelah tersedia media steril maka dilakukan penambahan ekstrak pada berbagai konsentrasi yang telah ditentukan. Proses penambahan ekstrak dilakukan dengan kondisi agar yang tidak terlalu panas untuk menghindari kerusakan senyawa aktif pada ekstrak, selanjutnya campuran dituang ke dalam cawan petri. Media yang telah berisi ekstrak dalam petri didinginkan dan tidak boleh ada uap air dalam cawan petri. Setelah itu S. marcescens digores di atas agar dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang. Alur proses pengujian genotoksisitas ekstrak kloroform daun katang-katang terhadap S. marcescens dapat dilihat pada Gambar 8. Gambar 8. Uji genotoksisitas ekstrak koloroform daun katang-katang terhadap S. marcescens. Ekstrak kloroform dengan konsentrasi 20, 200, 2 000, 20 000, 30 000, 40 000 dan 50 000 µgml dimasukkan dalam 15 ml media Dihomogenkan Pendinginan agar + ekstrak S. marcescens digores di atas agar Diinkubasi selama 24 jam suhu ruang Pengamatan hasil goresan Setelah diinkubasi 24 jam dilakukan pengamatan secara visual dengan melihat hasil goresan yang terbentuk. Apabila hasil goresan berwarna putih maka ekstrak tersebut bersifat genotoksik, namun apabila tetap terbentuk warna merah sebagaimana warna bakteri S. marcescens maka ekstrak tidak bersifat genotoksik atau aman untuk digunakan sebagai bahan obat. 3.3.6 Fraksinasi dan isolasi senyawa inhibitor topoisomerase I 3.3.6.1 Kromatografi Lapis Tipis KLT Pemisahan senyawa inhibitor topoisomerase I dilakukan dengan kromatografi lapis tipis KLT dengan mencari eluen yang cocok untuk pemisahan komponen aktif dari ekstrak kloroform daun katang-katang. Eluen yang terbaik dalam kromatografi lapis tipis akan digunakan dalam proses kromatografi kolom. Proses awal KLT adalah persiapan lempeng lapis tipis silika gel 60 F 254 dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 2 cm, diberi tanda garis dengan pensil pada jarak 1 cm pada kedua ujung lempeng. Ekstrak katang-katang ditimbang sebanyak 0.02 g dan dilarutkan dalam 0.5 ml pelarut asalnya. Eluen yang akan digunakan dimasukkan ke dalam tabung kromatografi hingga tingginya sekitar 1 cm dari dasar tabung dan ditutup rapat agar jenuh dengan uap eluen. Larutan ekstrak sampel diteteskan dengan pipa kapiler pada lempeng silika gel. Penetesan dilakukan pada jarak 1 cm dari salah satu ujung tersebut. Ujung lempeng yang terdekat pada tempat penetesan dicelupkan ke dalam tabung kromatografi yang sudah jenuh dengan eluen. Tabung kemudian ditutup rapat dan dibiarkan pelarut naik sampai batas yang ditentukan 1 cm dari batas atas Gambar 9. Gambar 9. Teknik kromatografi lapis tipis. Batas atas Batas bawah Setelah elusi pada batas tertentu, lempeng diangkat dan selanjutnya dikering udarakan selama beberapa menit, kemudian dideteksi dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan 365 nm. Pemilihan pelarut eluen pada proses KLT dilakukan dengan kombinasi pelarut yang berbeda yaitu sistem B yang terdiri dari pelarut toluen : etil asetat 7 : 3. Terpilihnya sistem B dengan perbandingan tersebut didasarkan atas penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Agustiningrum 2004. Hasil KLT ekstrak kloroform dengan sistem B diamati dengan sinar UV pada panjang gelombang 365 nm, selanjutnya dihitung nilai Rf dari masing-masing spot yang terbentuk.

3.3.6.2 Kromatografi kolom

Prosedur kerja fraksinasi dengan kromatografi kolom KK adalah sebagai berikut: 1 Kolom dipasang pada statif secara tegak lurus, pada bagian dasar kolom diberi glass wool dan diisi dengan pelarut sampai sepertiganya sebagai eluen. Kemudian dimasukkan silika gel yang telah disuspensikan dengan eluen. Campuran silika gel dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit agar diperoleh lapisan yang seragam Gambar 10. 2 Sebelum ekstrak dimasukkan dalam kolom, ekstrak dilarutkan dengan pelarut asalnya. Eluen yang digunakan pada KLT menjadi acuan untuk menentukan eluen pada kolom namun tidak sesederhana itu harus melalui tata kerja yang agak empiris dengan mengurangi komponen pelarut polar sampai harga Rf lebih kecil dari 0.3 pada KLT Gritter et al. 1991. 3 Ekstrak dimasukkan ke dalam kolom yang telah dijenuhkan kemudian dielusi dengan pelarut terpilih dan harus dihindari adanya gelembung udara dalam kolom. Pada pengelusian pelarut yang dimasukkan ke dalam kolom diawali dengan pelarut non polar baru dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar. Gambar 10. Sedian kolom kromatografi. 4 Setelah mendapatkan fraksi yang telah dipisahkan melalui kromatografi kolom, maka pelarutnya diuapkan hingga mendapatkan fraksi bebas pelarut. Selanjutnya dilakukan proses penotolan menggunakan teknik KLT untuk melihat pemisahan fraksi hasil kolom. Alur proses uji kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 11. Gambar 11. Alur proses uji kromatografi kolom.

3.3.7 Identifikasi fraksi hasil kromatografi kolom dengan analisis GCMS

Fraksi yang didapat dalam proses kromatografi kolom diencerkan dengan jenis pelarutnya kloroform, dianalisis komponen kimianya menggunakan GCMS Shimadzu QP2010, Japan dengan volume injeksi 2 µl dan kondisi alat yang telah diprogram. Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asalnya Fraksinasi dengan komatografi kolom silika gel dengan sistem terpilih Fraksi dievaporasi Penotolan menggunakan kromatografi lapis tipis Glass woal Fraksi tunggal Kolom yang digunakan jenis RTX 1 metil polisiloksan yang bersifat non polar, dengan gas pembawa adalah helium dengan suhu oven kolom 70 o C, suhu injeksi 230 o C dengan tekanan 160 kPa, total aliran 31.4 mldetik, aliran kolom 2.58 mldetik. Dalam analisis fraksi kloroform ini suhu kolom diprogram dari 70 o C sampai 280 o C dengan 2 tahap kenaikan. Pada tahap awal suhu kolom dibuat konstan 70 ºC selama 2 menit dan kemudian dinaikkan sampai suhu 280 o C dengan kecepatan rata-rata sebesar 5 o Cmenit. Suhu 280 o C dipertahankan konstan selama 20 menit. Suhu injektor diprogram konstan pada suhu 230 o C, sedangkan suhu detektor quadrupol diprogram konstan pada suhu 250 o C. Pendeteksian spektrum massa dimulai dari angka 20 mz sampai 500 mz. Spektrum massa setiap komponen fraksi F1 yang diperoleh selanjutnya diidentifikasi dengan cara membandingkannya dengan bank data WILEY7.LIB.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstrak Bahan Aktif Daun Katang-katang

Kriteria daun katang-katang yang dipilih sebelum dikeringkan dan diekstraksi adalah daun yang masih segar dan berwarna hijau. Kelima filtrat ekstrak hasil ekstraksi daun katang-katang yang dihasilkan berwarna hijau tua Tabel 2. Ekstrak heksana dan ekstrak kloroform memiliki warna ekstrak hijau tua yang lebih pekat dibandingkan ekstrak etil asetat, aseton, dan metanol. Hal ini disebabkan karena klorofil dapat terekstraksi oleh pelarut lipid seperti kloroform, aseton dan eter Harborne 1987. Ekstrak etil asetat, aseton, dan metanol memiliki warna hijau tua namun tidak terlalu pekat karena dimungkinkan klorofil sudah banyak terekstraksi pada proses sebelumnya yang menggunakan heksana dan kloroform. Tabel 2 Hasil pengamatan ekstrak daun katang-katang Ekstrak Warna ekstrak Wujud fisik Heksana Hijau tua Pasta Kloroform Hijau tua Pasta Etil asetat Hijau tua Pasta Aseton Hijau tua Pasta Metanol Hijau tua Pasta Keterangan: = hijau tua pekat = hijau tua = hijau tua lemah Kelima ekstrak daun katang-katang ditimbang bobotnya dan ditentukan rendemennya dalam satuan persen . Contoh perhitungan rendemen ekstrak daun katang-katang dapat dilihat pada Lampiran 2. Rendemen ekstrak daun katang-katang ditampilkan pada Tabel 3. Tabel 3 Rendemen ekstraksi daun katang-katang Bobot sampel g Pelarut Volume pelarut ml Bobot ekstrak g Rendemen Heksana 0.28 0.42 Kloroform 0.45 0.67 Etil asetat 0.22 0.33 Aseton 0.44 0.66 150 Metanol 300 1.93 2.89