Gambar 3. Peralatan KCKT Kazakevich dan Nair, 1996
Tiga variabel utama yang harus diperhatikan untuk proses pemisahan dan analisis menggunakan KCKT, yaitu :
a. Fase gerak
Pemisahan dengan fase gerak tunggal disebut elusi isokratik, sedangkan elusi gradien menggunakan dua fase gerak dengan berbagai perubahan komposisi.
Suatu KCKT yang baik seharusnya mempunyai lebih dari dua penampung fase gerak. Fase gerak dialirkan ke botol penyampur pada berbagai laju aliran. Sebagian
besar pompa KCKT mempunyai keluaran tekanan 70-400 atm, dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mlmenit. Sampel dimasukkan dalam sistem injeksi
dengan penyuntik hiperdermik. Sampel sejumlah 2-100 µl dapat ditampung dalam sistem injeksinya Khopkar, 1990.
Fase gerak untuk analisis secara KCKT harus murni untuk mencegah adanya peak pengganggu yang dapat tumpang tindih dengan peak analit, tidak
bereaksi atau mempengaruhi kolom, dapat melarutkan analit, memiliki titik didih 20- 50
o
C di atas temperatur kolom, viskositasnya rendah tidak lebih dari 50 cP dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
memungkinkan untuk memperoleh kembali analit dengan mudah jika diperlukan, tidak mudah terbakar dan toksisitasnya rendah, memiliki harga yang wajar Skoog,
Holler, dan Nieman, 1985. Fase gerak KCKT juga harus bebas dari gas yang terlarut karena dapat mempengaruhi respon detektor sehingga memuculkan sinyal palsu dan
akan mempengaruhi kolom Gritter, Bobbit, Schwarting, 1985. Maka peralatan degassing
diperlukan untuk menghilangkan gas yang terlarut di dalam fase gerak Dean, 1995.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril Rohman dan Gandjar, 2007. Variasi retensi analit untuk pemisahan yang optimum dicapai dengan
mengubah komposisi fase gerak. Snyder mendefinisikan parameter solvent strength, e
o
, sebagai energi adsorbsi per unit area dari adsorbent. Kenaikan nilai e
o
berbanding lurus dengan kenaikan nilai log k’. Semakin besar solvent strength maka kekuatan
fase gerak untuk mengelusi semakin besar dan menyebabkan semakin kecilnya nilai k’ faktor pemisahan untuk kurva analit. Dengan demikian, fase gerak dapat dipilih
dengan mencocokkan polaritas relatif dari fase gerak dengan komponen sampel Willard, Merrit, Dean, dan Settle, 1988.
Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut untuk mengelusi suatu senyawa. Kepolaran pelarut dinyatakan dalam bentuk P’ indeks polaritas.
Besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan persamaan berikut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
n n
n i
camp
P P
P P
P .....
2 2
1 1
1
Φ +
Φ +
Φ =
Φ =
∑
=
2 dengan F merupakan fraksi pelarut dalam campuran dan n adalah jenis pelarut yang
digunakan Skoog et al., 1985. Berikut ini merupakan beberapa nilai indeks polaritas dari beberapa pelarut
yang sering digunakan.
Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut
Nilai Eluotropik Solvent
Indeks Polaritas
Alumina C
18
Silika UV Cut off
nm Heksan
0,1 0,01
- 0,00
195 Sikloheksan
0,2 0,04
- -
200 Toluen
2,4 0,29
- 0,22
284 Tetrahidrofuran
4,0 0,45
3,7 0,53
212 Etil asetat
4,4 0,58
- 0,48
256 Aseton
5,1 0,56
8,8 0,53
330 Metanol
5,1 0,95
1,0 0,7
205 Asetonitril
5,8 0,65
3,1 0,52
190 Dimetilformamida
6,4 -
7,6 -
268 Dimetilsulfoksida
7,2 0,62
- -
268 Air
10,2 -
- -
190 Snyder, Kirkland dan Glajh, 1997.
Tabel di atas menunj ukkan bahwa semakin besar nilai eluotropik dari suatu pelarut maka semakin mudah untuk mengelusi analit. Sedangkan semakin besar
indeks polaritas pelarut maka semakin polar pelarut tersebut Snyder et al., 1997.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Fase diam
